基因检测的当前和未来 |
自身炎性疾病是由调节先天免疫力的基因缺陷引起的，导致先发炎性细胞因子如IL-1，IL-6，TNF和I型干扰素的大量产生。通常，患者表现为发炎，发烧，急性期反应物升高以及一系列组织和器官特异性表现。尽管有独特的临床特征可帮助系统性自身炎性疾病的鉴别诊断，但临床表现仍有相当多的重叠之处。最可预测的标准包括发病年龄，发烧和疾病发作的持续时间，皮疹的存在和类型，中枢神经系统受累，阳性家族史和患者的血统。然而，关于SAID的临床诊断的适用性存在若干问题。首先，除了原型性自身炎症性疾病外，大多数已知疾病尚未开发出遗传性复发性发热，临床分类临床诊断标准。其次，建议的临床标准缺乏准确性，即它们既非高度特异性也不敏感。考虑到不同基因的突变可能导致类似的疾病，这一点是可以理解的，就像家族性冷性自发性炎症综合症和艾卡迪－古蒂雷斯综合症的患者一样，这与三个和八个不同基因的因果变异有关。同一个基因的突变会导致疾病严重程度和表现形式的巨大差异，就像炎症性顺势疗法和与吡啶相关的疾病一样。SAID的差异诊断也可能具有挑战性，因为在不同基因中具有致病性突变的患者可能表现出相似的临床特征，就像在家族性冷性自身炎综合征患者中一样。此外，疾病的表达可能受到修饰的基因等位基因，表观遗传修饰和环境因素的影响。最近发布了针对四个原型HRF的新的基于证据的分类标准，它们包括临床特征和基因型的组合，因此它们具有更高的特异性和敏感性。但是，没有现有的临床分类标准在遗传多样的人群中得到开发或验证。因此，分子诊断已成为临床管理的组成部分，可以帮助临床医生选择合适的治疗方法。在这些通常终身且毁灭性的疾病中，针对驱动SAID中炎症的特定细胞因子的生物疗法在抑制疾病活动方面非常有效。
大多数单基因SAID通过一种经典的遗传方式遗传，即常染色体隐性遗传或常染色体显性遗传。具有常染色体隐性遗传病的个体必须在同一基因中以纯合或复合杂合状态携带双等位基因致病变体。除非从头产生一个突变，否则每个致病性突变都必须从每个未受影响的亲本传播。在病人身上。强烈建议进行家长检查，以从分子水平确认临床诊断。隐性遗传疾病的病理生理学通常可以通过功能丧失机制来解释，这是两种等位基因的蛋白质表达功能丧失导致疾病的原因。这些突变通常出现在编码无处不在表达的酶的基因中，并导致生命早期出现更多的整体表型。隐性遗传性SAID的经典例子是甲羟戊酸激酶缺乏症，它是由MVK基因的双等位基因突变引起的。其他示例包括由ADA2中的双等位基因突变引起的腺苷脱氨酶2缺乏症TRNT1基因的双等位基因突变引起的铁粒母细胞贫血和伴有B细胞免疫缺陷，周期性发烧和发育延迟的铁粒幼细胞性贫血。
显性遗传疾病是由单个致病变异引起的，该变异在配子发生过程中从头出现或从受影响的父母那里遗传。但是，在显性遗传特征中外显率降低的例子有因果突变，其原因突变是从未受影响的父母那里继承的，或者存在于其他未受影响的家庭成员中。显性遗传SAID的典型例子是炎性匀称病，其中患者携带杂合错义突变，导致蛋白质功能增强。当基因的单个功能拷贝不足以维持蛋白质功能时，单倍基因不足会成为主要遗传SAID的另一种机制。这个例子包括A20的单倍型不足，这是由TNFAIP3基因的突变所引起的。必须进行父母测试以确认从头突变。大多数显性遗传的病原体是新颖的，但在人类基因等位基因的大型公共数据库中，有些报道的频率很低。
镶嵌已在SAID中进行了描述，它是一种可导致非典型或意外继承方式的机制。马赛克是由合子后发生的从头突变引起的，即所谓的体细胞突变，其导致单个个体内两个遗传上不同的细胞群体。NLRP3的致病性体细胞突变已显示出会导致新生儿发作的多系统炎性疾病[也称为慢性婴儿神经系统皮肤和关节综合征]，Muckle-Wells和Schnitzler综合征，而且，取决于哪些细胞类型和组织携带改变的基因型，疾病表现和发病年龄差异很大。引起疾病的体细胞突变主要见于常染色体显性遗传的SAIDs中，通常只有一小部分突变细胞，特别是髓系细胞，足以引发炎症过程。如果在其他类型的细胞中也发现了体细胞突变，则称其为种系或性腺嵌合体，该突变可能会传给下一代。种系嵌合体已经报道患者布劳综合征和与肿瘤坏死因子受体1相关周期性综合症，引起在突变NOD2和TNFRSF1A。最近，在婴儿期STING相关的血管病患者和NLR家族的CARD域含蛋白4相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增多症疾病的患者的角质形成细胞中已发现体细胞突变。
二元论是引起非孟德尔遗传的另一种机制。虽然遵循孟德尔遗传的单基因性状是由单个基因中的一个或两个突变引起的，但如果两个不同基因中同时发生突变，则表明存在双基因疾病。鉴于下一代测序允许对许多基因进行并行测序，因此大大促进了发现具有双基因或寡聚遗传的疾病。除非通过基于家庭的隔离分析证明，否则在单例患者中鉴定出两个或更多个不同基因中的致病变体并不是对双基因现象的确认。通常在属于同一多蛋白复合物一部分的蛋白中鉴定出双基因致病性变体。双基因SAID的经典示例是一组与蛋白酶体相关的自身炎症综合症，也称为慢性非典型嗜中性皮肤病，伴有脂肪营养不良和高温综合征。大多数CANDLE综合征患者在编码蛋白酶体亚基B8型的基因中隐性遗传了纯合子或复合杂合子的稀有或新突变。然而，在一些患者的蛋白酶体相关的自身炎症综合征只有一个突变PSMB8发现了这种假说，这些假说导致这些患者可能在编码组成型蛋白酶体或免疫细胞特异性免疫蛋白酶体亚基的任何其他基因中携带第二种致病变异。随后，发现这些患者的一部分在两个不同的基因中带有杂合突变。此外，严重的CANDLE表型伴有嗜中性粒细胞性皮肤病和免疫缺陷，与蛋白酶体成熟蛋白的杂合突变有关，这对于蛋白酶体的成熟至关重要。
在其他类型的最初未鉴定的SAID中也已报道了双基因和寡聚遗传。寡聚遗传类型是单基因遗传和多基因遗传之间的连续体，因此表型是由几个低频变体的共存产生的。等位基因频率不足以解释与罕见疾病的关联，并且通常在未受影响的父母中发现这些变异。由于这些等位基因对蛋白质功能的影响在很大程度上是未知的，因此通常将它们报道为临床意义未知的变体。与携带相同基因的新型/罕见变体的患者相比，这些变体通常在具有非特异性和较轻的炎症表型的患者中发现。人们认为它们起协同作用来诱发炎症。最著名的例子包括p.R121Q和p.P75L在TNFRSF1A，p.E148Q和p.P369SMEFV，和p.V198M，p.R488K和p.Q703K在NLRP3中。在周期性发热，口疮性口炎，咽炎和腺炎综合症患者中，其中一些变异体的发生频率更高。
大多数已知的SAID是单基因疾病，但也存在许多多因素和复杂的SAID，例如贝塞特氏病，系统性幼年特发性关节炎和克罗恩氏病。基本假设是，这些常见的和遗传上复杂的自身免疫性疾病/自身炎症性疾病可归因于在适当的环境因素存在下常见的降低免疫力的变异的协同效应。这些敏感性变异是通过在不相关患者和健康对照的大型队列中进行全基因组关联研究确定的。已知的例子包括IL1A-IL1B，IL-10，IL23-IL12RB2，ERAP1中的风险等位基因和HLAI类基因座在BD患者和在AJAP1，COL11A1，HDAC9，ENC1和HLAII类基因座的患者。这些复杂的遗传疾病不适合遗传诊断和遗传咨询，因为在无症状人群中也发现了这些风险变异或单倍型。但是，如果没有对可能患有多因素疾病的患者进行适当的基因检测，就不能排除可能的孟德尔遗传原因。在过去的几年中，很明显SAIDs的致病性不仅由遗传因素决定，而且环境和表观遗传因素在疾病表达中也起着至关重要的作用。表观遗传因素定义为不影响基因组DNA序列的基因表达的遗传变化。由于表观遗传学的变化不如DNA突变稳定，并且更容易调节，因此它们可用于整合环境信号，并介导环境与所得基因组输出之间的相互作用。最好的表观遗传机制包括DNA甲基化，组蛋白修饰，染色质重塑和非编码RNA，其中一些与SAID的发病机制有关。
在某些人群中，经典和特征明确的疾病并非绝对需要对SAIDs进行基因检测，但对于预测疾病进程和家庭遗传咨询可能非常重要。目前，除原型HRFs外，尚无针对SAIDs进行基因检测的通用建议：FMF，MKD，TNFR1相关的周期性综合症和冷冻蛋白相关的周期性综合症。应根据患者的表型和怀疑的致病基因选择适当的基因检测方法。由于不同SAID之间存在明显的临床重叠，因此鉴别诊断可能需要对多个基因进行顺序或同时分析。一般不推荐产前诊断，虽然这可能是新的隐性遗传疾病的严重的和潜在致死表型被识别发生变化，例如，线性泛素链组装复杂的缺陷和Aicardi-Goutières综合征。
Sanger测序仍然是大多数SAID分子测试的主要内容。这种方法非常适合NGS方法无法盈利的低通量实验室。推荐用于患者具有明显的临床诊断或用于测试突变热点或测试创始人群体中的突变。Sanger测序还可帮助MKD或DADA2患者进行生化诊断，从而为遗传咨询提供重要信息。此外，Sanger测序在确定通过NGS方法鉴定的变异体中也仍然是必不可少的。但是，除了来自FMF和MKD创始人人群的患者外，SAID中Sanger测序的性能和效率均很低。
对于满足几种可能疾病的标准表现出歧义表型的患者，NGS面板是当前的选择方法。最初，NGS相对昂贵，但是方法和技术的飞速发展已将其转变为一种既省时又经济的测序技术。NGS基于一项新技术，该技术每次运行可生成并分析数百万个序列读数。即使不同的商用NGS平台在其特定方法上有所不同，但常规测序过程仍包含相同的步骤。首先，通过酶消化或超声处理将DNA样品片段化。然后将DNA的短片段体外连接至样品特异性衔接子，然后在涂有互补引物的固体表面上进行所谓的Bridge-PCR步骤。随后，通过焦磷酸测序，通过连接测序或通过合成测序对扩增产物进行测序。然后将得到的序列读数与参考基因组进行比对，最后应用变异调用算法将映射的读数与参考基因组进行比较，以识别潜在的变异。
现在，NGS主要在靶向基因组的背景下，越来越多地用于临床环境中的自身炎症性疾病的诊断。在这些基因组中，特定基因组的完整编码序列被特异地富集并测序。商业和研究诊断实验室使用的SAID基因组的确切组成不同，但通常包含经典的自体炎症基因。可用的SAID基因组的概述可在基因测试注册数据库中找到。一个全面的基因检测面板可包括一对夫妇数百免疫相关基因的诊断率不高于30％。如果可以通过体细胞突变来解释表型，也建议使用NGS基因检测。这些包括但不限于NLRP3，NOD2，TNFRSF1A，TNFAIP3和TMEM173。使用靶向基因组作为具有非特征性自身炎症综合症的个体的基因测试方法，也增加了诊断具有双基因或寡基因遗传的SAID的可能性。
取决于用于靶标富集的特定捕获试剂盒，全外显子组测序可用于对更多基因进行测序，甚至对人类基因组的几乎整个编码区进行测序。尽管有几项研究表明，与NGS基因组相比，其诊断率有所提高，但WES尚未用于常规诊断中。与基因组相比，其临床实施方面的障碍包括对计算基础架构的更高要求，仍然更高的成本和减小的读取深度。同样重要的是要牢记，复制号变体取决于其大小，很容易被该技术遗漏。另一个限制因素是在每个个体的整个外显子组数据中仅存在数千种稀有的单个变体而没有明显的致病作用。这使得对WES中遗传变异的解释变得复杂且耗时。但是，在未确诊的情况下应考虑使用WES，如果可能，应在基于家庭的三重方法的背景下考虑WES。新出现的数据证明，WES导致提高诊断率和成本的降低与标准的诊断测试相比，如果在诊断过程中早期执行。此外，从研究的角度来看，WES包含发现已知导致疾病的基因中新变异的能力，甚至还可能发现尚未与人类疾病相关的新基因。许多基因检测提供者还提供了一种所谓的外显子切片技术。这种方法仍然可以捕获整个外显子组并对其进行测序，但是该分析在信息学上仅限于特定的基因列表。此方法最适合具有明确定义的表型无法获得全面基因组的个体。由于分析流程将仅报告有关预定义列表中包含的基因的数据，因此将减少假阳性变异的负担。
与WES相比，全基因组测序旨在以无偏见的方式捕获完整的人类基因组。除了检测常规方法发现的所有致病变体之外，WGS还具有在非编码调控区中识别深度内含子变体和其他隐性突变的潜力，因此可提高诊断率。此外，与WES相比，全基因组范围内的均匀分布覆盖范围使CNV的识别更加可靠。WGS的另一个重要优点是可以定期重新分析最近发现或重新分类的变体的全基因组数据。尽管关于WGS在多种遗传疾病的临床诊断中的有效性和益处的证据不断涌现，但在研究环境中，它仍主要用于发现新型疾病基因。
与Sanger测序相比，由于NGS方法检测到的变异数要多得多，因此对序列变异和因果关系的解释和理解变得更加复杂。因此，对遗传变异的临床意义的正确估计需要清晰而透彻的指导方针，以使解释过程标准化。这种需求导致美国医学遗传学和基因组学学院以及分子病理学协会在2015年开发了一种结构更全的工作流程，用于变体解释。他们的指南建议评估每种变体对致病性的不同证据。然后根据评分方案组合不同的标准，以便应用五层分类系统的最终变体分类。具体而言，对于HRF，国际系统性自身炎性疾病研究小组最近应用了一种新的工作流程，对四个基因的遗传变异进行分类。与原型HRF综合征相关的基因中最常见的致病变异是核苷酸的非同义变化，并且除了MVK之外，很少发生结构突变。最近，在IL1RN，IL36RN和TNFAIP3基因中报道了与IL-1受体拮抗剂，IL-36受体拮抗剂和HA20缺乏有关的蛋白截短突变。IL1RN，ADA2和TNFAIP3基因位点中鉴定出罕见的大基因组缺失。可以在在线数据库Infevers中找到与自身炎症性疾病相关的分类变体的完整列表。
美国医学遗传学和基因组学/分子病理学协会的大多数变体解释标准都依赖计算机模拟预测特定变体对蛋白质功能的影响。通常，这些标准使用有关类似变体的功能和临床影响的最新知识来预测所讨论变体的致病性。显然，随着对分子疾病机理以及特定基因或蛋白质功能域的更多了解，该类别的预测价值会增加。例如，只有已知致病的潜在机制是功能丧失，才可以将非常强的致病性标准应用于截短蛋白的变体。该类别中的其他标准依赖于蛋白质重要功能区域内变体的现有知识。种群数据是支持已鉴定变异体致病性的重要证据。预计导致严重疾病等位基因频率在一般人群中很少见，在任何人群中，>5％的频率被认为是“独立”良性分类。人群范围内的变异资源包括外显子组聚集协会，基因组聚集数据库和1000基因组计划。但是，在应用这些标准时，必须认识到可能影响等位基因人群频率的因素，例如疾病流行率，表达力，渗透性和遗传异质性。
在此类证据中，考虑了特定变体对蛋白质功能的影响的分子和细胞生物学数据。并非所有功能性实验都可用于预测特定变体的致病性，因此质疑特定测定与疾病机理和表现的生物学相关性极为重要。例如，尽管许多自身炎症性疾病是由细胞因子IL-1B介导的，但不应通过测量患者血清样品中血清中细胞因子的产生来评估新型NACHT，LRR和PYD结构域蛋白3的致病性。IL-1B的水平在功能上无关紧要。一种更可靠的功能分析是测量刺激的外周血细胞上清液中IL-1B的产生。在研究和临床测试中应始终使用适当的功能性IL-1B测试。此外，功能性实验的主观性质和变异性可能会导致实验室间在解释候选变体的临床相关性方面存在显着差异，并做出了巨大的努力以提高变体预测的一致性。因此，至关重要的是，必须在临床诊断实验室中对功能测试进行验证，以实现较高的临床有效性和实用性。用于所述因果基因特定功能测试仍然很少有引起的酶缺陷的疾病的异常：MKD，DADA2和磷脂酶Cγ2相关的疾病。
由于单基因疾病有望以孟德尔方式遗传，因此家族中特定变体分离的证据也可用于解释其临床意义。例如，从头出现变体如果满足以下几个条件，则被视为有力的致病证据：确认产假和父亲身份；存在与表型一致的疾病相关基因；父母一定不受影响。对于显性遗传性疾病，受影响家庭成员中疾病的共隔离可以用作致病性的佐证。相反，从一个未受影响的父母那里继承一个变体被认为是该变体是良性的有力证据。所描述标准的应用在很大程度上依赖于对包括的所有家庭成员的准确和正确的表型评估，因此可能会受到诸如渗透率，表现力和疾病发作年龄等因素的影响。对于任何孟德尔条件，对SAID的确定性遗传诊断均基于发现致病基因中明确的突变。从理论上讲，在隐性疾病中发现两个双等位基因明确的致病突变或在显性疾病中发现一个突变将确认诊断。必须已经知道引起杂合子突变的疾病，或者如果它们是新的从头突变，实验室应仔细评估这些突变的临床相关性。在所有其他情况下，患者护理应基于临床依据，并且不应阻止开始治疗
如果仅通过给定方法测试已知致病突变的一部分，则灵敏度可能会受到限制。例如，专注于特定基因编码区的测序方法可能会错过深度内含子变体或可能影响蛋白质翻译和表达的顺式调控元件变体。但是，迄今为止，还没有针对SAID所描述的深度内含子变体或调节元件中的变体。在某些情况下，第二个隐性突变可能不容易识别，需要进行其他分析。对于DADA2，例如，几个致病缺失和重复包括一个或几个外显子ADA2基因已经描述。根据那些CNV的大小，仅Sanger测序不足以检测到它们，需要更复杂的实验室技术，例如依赖于多重连接的探针扩增，数字液滴PCR或NGS方法。有限的测试敏感性的另一种解释是体细胞突变，其低于特定基因测试方法的检测阈值。即使Sanger测序是一种可靠，稳健实验验证的方法，它是不够敏感检测的20％频率以下的体细胞突变。
可能导致明显的阴性基因检测的其他因素可能来自对结果的误解。最好的例子是引起FMF的MEFV基因。根据隔离分析，FMF长期以来一直被认为是一种隐性疾病。作为致病性变体的频率MEFV不同群体之间显著变化时，用于寻找双等位基因的突变所估计的灵敏度从70％至取决于患者的种族背景95％。然而，在某些FMF病例中，仅鉴定出MEFV中的一个已知致病突变。此外，在热蛋白的其它域的杂合突变已在家庭发现清楚地显性遗传热蛋白相关的疾病。其中之一是热蛋白相关自身炎症与嗜中性白细胞皮肤病，显性遗传疾病在位置242或244引起氨基酸取代，其是用于抑制热蛋白临界。PAAND患者的表型与化脓性关节炎，坏疽性脓皮病和痤疮综合征非常相似，后者是由PSTPIP1中的杂合突变引起的基因。有趣的是，脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸磷酸酶相互作用蛋白1和吡啶是已知相互作用的蛋白，它们与细胞骨架有关。类似于MEFV，继承的复杂模式已为描述NLRP1基因相关的疾病。最后，具有明显SAID的患者的基因检测结果阴性可能仅是由于尚未鉴定出致病基因。
在过去的20年中，具有分子特征的SAID的数量迅速增长，并且受到新测序技术的发展的推动。尽管在与甾体抗炎药相关的新基因和途径的鉴定方面取得重大进展，越来越多的致病基因都还是未知数的患者50％以上是突变阴性。因此，对于未确诊的患者，建议定期进行基因检测机会的重新评估和分析。正在开发新的NGS技术和算法，以帮助检测和分类所有遗传变异。关于遗传模式和变异致病性解释的新概念将需要系统地审查和更新遗传诊断策略，以及对遗传检测的标准化和报告提出新的指导。
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