【佳学基因检测】基因检测米勒管异常和高雄激素血症的发病原因以阻断遗传
在一项旨在发找发病原因、阻断遗传的基因检测研究中，生殖科基因检测项目分析了4名患有Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser综合征和高雄激素血症的染色体型为46，XX的青春期女孩。基因检测揭示患者体内的WNT4基因的分子分析揭示其具有一种新的基因突变（p.A233T）。功能研究显示，类固醇生成酶的部分抑制（HSD3B2的正常抑制）与OVCAR3细胞系中CYP17A1酶的异常再表达形成对比。第四个新的WNT4突变证实了这种信号分子参与了卵巢中的米勒发育和雄激素生物合成抑制。基因解码还发现，该突变体部分缺乏抑制卵巢类固醇生成酶的能力，17α-羟化酶表达异常。
查询《生殖器官发育异常基因检测》数据库，记录中存在三名携带 WNT4 基因杂合突变的少女。所有这些都显示人类生殖科这一疾病与 Wnt4 敲除小鼠惊人相似的表型表现：苗勒管发育不全或与高雄激素血症的临床和/或生物学证据相关的发育不全。对基因检测突变体的体外研究表明，这些蛋白质无法抑制 3β-羟基类固醇脱氢酶 2 (HSD3B2) 和 17α-羟化酶 (CYP17A1) 的表达，从而诱导雄激素过量产生，或稳定 β-连环蛋白，导致子宫发育不全。
生殖科致病基因鉴定基因解码基因检测贼近开展了一项合作研究，该研究分析了 WNT4 基因是如何参与女性生殖道和性腺发育的。苗勒管发育不全基因检测报告了四名青春期女孩的 WNT4 基因分析结果，这些女孩因存在原发性闭经和与正常 XX 核型和苗勒管缺陷相关的雄激素过多症而转诊至儿科内分泌和妇科诊所。在这四个女孩中，女性生殖障碍基因检测项目组发现了一种新的 WNT4 突变，然后通过体外系统对类固醇生成酶抑制和 β-连环蛋白稳定化进行了表征。体外实验出人意料地揭示了这种新的 WNT4 突变体仅特异性地去抑制一些类固醇生成酶，这与之前鉴定的基因突变所产生的有效去抑制形成对比。
该项研究邀请机构审查委员会的参与并批准了这项研究，四名患者均提供了知情同意书。她们呈现与苗勒管异常和雄激素过多症相关的正常 46,XX 核型。患者 1 为 15 岁，患有子宫发育不全和严重的痤疮。血浆睾酮 (pl-T) 和 DHEA 水平升高：分别为 2.4 nmol/L（正常 0.3-2 nmol/L）和 10.2 μmol/L（正常 1.3-6.8 μmol/L）。基础 LH 水平高（12.2 UI/L；正常 1.5-6 UI/L），对 LHRH 测试的反应增加（LH 峰值 19 UI/L）。患者 2 为20 岁，超重（身高 165 厘米，体重 85 公斤）和多毛症。 Pl-T (3.4 nmol/L) 和 DHEA (14.7 μmol/L) 升高。 LHRH 测试显示高度升高，峰值为 75 UI/L。超声检查显示子宫发育不全。患者 3 为23 岁，患有与多毛症和痤疮相关的子宫发育不全，并且激素水平相同：高 pl-T（3.5 nmol/L）、雄烯二酮（14.1 nmol/L；正常 1.7-6.9）和 DHEA（9.15 μmol/ L)。患者 4年龄为17 岁，患有严重的痤疮和面部和背部多毛症。基础 LH 水平增加（10.1 UI/L）。雄激素升高（pl-T：3.6 nmol/L；雄烯二酮：11.4 nmol/L；DHEA：7.0 μmol/L）。超声检查显示子宫发育不全、左侧异位卵巢、罕见卵泡和盆腔左侧肾脏。
在从外周血白细胞中提取 DNA 并对 WNT4 基因的四个外显子进行聚合酶链式反应 (PCR) 扩增后，生殖科基因检测组进行了直接测序。 DNA 的基因检测分析揭示了患者 1 中的新 WNT4 基因突变。基因检测结果在 ORF 的 697 位发现了杂合的鸟嘌呤到腺嘌呤取代（c.697G> A），导致 WNT4 蛋白序列中的 p.A233T 取代.
WNT4 通过 WNT/β-连环蛋白稳定途径专门参与两性生殖道发育和雌性胚胎中性腺组织的分化。为了确定 WNT4 突变参与观察到的子宫发育不全，女性生殖障碍基因检测组转染突变型、野生型 (WT) 或两者的组合后量化了 OVCAR3 细胞核中的 β-连环蛋白。当突变体 p.A233T WNT4 在 OVCAR3 细胞中过表达时，β-连环蛋白的量显着减少（P=0.0171）。在单独用突变体 WNT4 或与等摩尔量的 WT 蛋白组合转染的细胞中，来自这些细胞的核裂解物中的 β-连环蛋白的量减少。这表明信号通路减弱，因为经典 WNT 信号级联的激活导致 β-连环蛋白稳定。实际上，雌性 Wnt4-null 小鼠不能发育苗勒管，而沃尔夫管是稳定的。 WNT4 转导机制通过 β-连环蛋白稳定化发挥作用，其参与苗勒管的发育。 β-连环蛋白稳定化的体外研究证实了这种突变与人类苗勒管发育不全有关。在基因解码过程中，WNT4 突变体不能稳定 β-连环蛋白的表达，并且至少需要 3 倍过量的 WT 构建体来克服突变体效应。与其他报道的突变一样，这表明 WNT4 p.A233T 突变体具有显性负效应。
为了研究突变的功能意义，生殖科基因检测研究组在人卵巢腺癌细胞系 NIH:OVCAR3 (ATCC HTB-161) 中表达了 WT 和突变体 WNT4 cDNA，并分析了 WNT4 变体对类固醇生成酶表达和活性的影响，如先前报道的那样。 mRNA 水平分析（实时定量 PCR 和逆转录 PCR 定性 mRNA 测定）显示 WT 对 CYP17A1 mRNA 有良好的抑制作用，但 p.A233T 突变的 WNT4 单独或与 WT 组合没有抑制作用。当分析 HSD3B2 时，观察到这种 WT 对 mRNA 表达的抑制。令人惊讶的是，p.A233T WNT4 突变体能够正确抑制 HSD3B2 mRNA 的表达。
然后通过测量转染 WNT4 并以 100 nmol/L 孕烯醇酮作为前体后卵巢细胞培养基中分泌的类固醇的量来评估这些酶的活性。 WT WNT4 降低了 17-羟基孕酮 (17OHP)、DHEA 和雄烯二酮的含量。正如预期的那样，突变体 p.A233T WNT4 未能减少 DHEA 的产生，而它仍然能够减少 17OHP 和雄烯二酮的产生。为了证实对 mRNA 类固醇生成酶的部分抑制，生殖科基因检测通过测量转染 WT 或突变体 WNT4 和 100 nmol/L DHEA（测试 HSD3B2）或孕酮（测试CYP17A1）作为前体。该突变体能够减少DHEA产生的雄烯二酮，而它失去了减少黄体酮产生17OHP的能力。
在 Wnt4 缺陷的雌性小鼠中，参与睾酮生物合成的两种关键酶 3β-羟基类固醇脱氢酶和 CYP17A1 的过表达强烈支持卵巢的部分男性化。 WNT4 似乎阻止了胎儿卵巢中的 Leydig 细胞分化。关于先前报道的三例 WNT4 突变女孩，细胞内模型中 CYP17A1 和 HSD3B2 的不适当表达支持 WNT4 在类固醇生成酶表达中的抑制作用，这已通过临床高雄激素血症和受影响患者的血浆雄激素水平升高得到证实.然而，这里报道的病例与那三例与高雄激素血症相关的非典型 Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH) 综合征略有不同，因为 HSD3B2 的 mRNA 表达改变与 CYP17A1 不同。事实上，p.A233T WNT4 突变体不能抑制 CYP17A1 的表达，而 HSD3B2 的抑制作用得以维持。这是先进次观察到 WNT4 突变体对特定类固醇生成酶的抑制作用。总之，这些数据表明 WNT4 突变导致雄激素合成酶的特定调节，并且表型数据可能与基因型相关。
其他三个具有相同表型（苗勒管发育不全和雄激素过多症）的青春期女孩没有 WNT4 突变强烈表明可能涉及 WNT4/β-连环蛋白信号通路的其他成分。已知 WNT 分泌的蛋白质与 Frizzled 家族的受体结合，启动至少三个导致细胞行为基因表达调节和/或变化的细胞内途径。经典途径涉及来自低密度脂蛋白受体家族 (LRP6) 的辅助受体，并导致细胞内 β-连环蛋白的稳定。 β-连环蛋白是一种多功能蛋白，可作为进入细胞核的转录调节因子。然而，它通过由腺瘤性结肠息肉 (APC) 和轴蛋白组成的复合物磷酸化后被泛素化迅速降解，这促进了酪蛋白激酶 1 和糖原合酶激酶 3 (GSK3) 对 β-连环蛋白的磷酸化。 WNT 蛋白与表面受体的结合导致蛋白质的活化，当蛋白质蓬乱时，反过来使破坏复合物失活，使 β-连环蛋白在细胞质中积累并进入细胞核。在没有 WNT4 结合的情况下，不会发生 β-连环蛋白的稳定化，从而导致靶基因表达的改变。当未检测到 WNT4 异常时，这种 WNT 信号通路的改变可能与 MRKH 综合征的雄激素过多症有关。 贼近的研究报告没有 WNT4 基因突变，但这可能是因为招募了没有高雄激素血症临床或生物学证据的患者。佳学基因重新审视了 MRKH 综合征的分类和广泛的 MRKH 亚型。与高雄激素血症相关的非典型 MRKH 综合征被认为属于苗勒管发育不全的谱系。鉴于其非常典型的特征和 Biason-Lauber 工作所提供的进步，佳学基因建议将这种特殊的 MRKH 表型称为 Biason-Lauber 综合征
