【肿瘤靶向药物基因检测】使用噬菌体选择肽的高通量测序鉴定癌症特异性受体突变 EGFRvIII 的新型肽配体

来源：肺癌靶向药物基因检测
作者：噬菌体展示技术
时间：2023-01-31 02:47
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神奇药检测基因两万有必要吗——标准

与专家交流选择如何有效的药物治疗知道《Sci Rep》在 2022 Dec 1;12(1):20725.发表了一篇题目为《使用噬菌体选择肽的高通量测序鉴定癌症特异性受体突变 EGFRvIII 的新型肽配体》肿瘤靶向药物治疗基因检测临床研究文章。该研究由Sourour Mansour, Indranil Adhya, Coralie Lebleu, Rama Dumpati, Ahmed Rehan, Santu Chall, Jingqi Dai, Gauthier Errasti, Thomas Delacroix, Raj Chakrabarti等完成。

癌细胞通常显示出大量的某些细胞表面分子，例如肿瘤相关抗原或特异性受体，这些分子很少出现在正常组织中，代表了肿瘤诊断和治疗的潜在目标。 EGFRvIII 存在于许多人类恶性肿瘤中：卵巢癌、乳腺癌和胶质母细胞瘤，但从未在正常组织中发现过。因此，突变受体是开发新的癌症特异性配体的明显选择。因此，筛选和鉴定特异性结合EGFRvIII受体的肽将有助于开发用于癌症检测和治疗的新型探针。为此，肿瘤靶向药物研究团队使用 12 聚体噬菌体展示肽库来获得特异性结合 EGFRvIII 受体的肽。考虑到最终目标是在靶向药物递送系统中使用 EGFRvIII 特异性肽，佳学基因检测提出的关键参数是靶向细胞的特异性。构象表位靶向是无正常组织毒性的特异性靶向的关键概念。事实上，溶液中的 EGF 受体在未受刺激的条件下主要作为单体存在。 EGFR 激活过程包括多个步骤：配体诱导的构象变化和 EGFR 二聚化导致酪氨酸残基的反式磷酸化和自身磷酸化。这允许暴露某些称为构象表位的表位。 EGFR 的激活通常是由配体的结合引起的。然而，由于 EGFR 过表达，允许该表位暴露的条件优先发生在肿瘤特异性条件下。

最常见的筛选策略包括使用纯化的特异性靶标，将其吸收到固相中，然后通过 ELISA 筛选结合。使用这种方法，使用纯化的重组蛋白选择的肽可能无法进入活细胞中的靶标。此外，由于成本和时间相关因素，测序通常只在最后一轮进行，掩盖了不同肽命中的分析和随后的多轮富集。为了最大限度地降低这种风险，肿瘤靶向药物基因检测基因解码对 EGFRvIII 的细胞外活性形式采用了直接捕获淘选，因此构象表位也在溶液中瞬时显示。对于从洗脱的噬菌体中选择肽，使用高通量测序来分析分离肽的丰度和多样性，以及识别目标结合肽基序。因此，佳学基因靶向药物研究团队能够选择与这种瞬时构象结合的肽。科学家团队进一步证实了在稳定表达 EGFRvIII 受体的完整和活细胞上使用噬菌体展示肽作为靶细胞的结合，这确保了更具体的靶标和可以特异性结合表达 EGFRvIII 受体的细胞的肽的分离。

在这项研究中，使用高通量测序分析根据多轮富集确定的热门命中，从第三轮生物淘选中选择了五种肽。在细胞流式细胞术之前对选定的肽进行了肽克隆和测序验证。随后，使用流式细胞术进一步测试了五种噬菌体展示的肽，以确认它们与 EGFRvIII 细胞的特异性结合。为了减少选择用于结合确认的每个噬菌体展示肽的非特异性结合，在与 EGFR WT 和 EGFRvIII 细胞孵育之前，将扩增的噬菌体与吸收亲本 HEK 细胞混合。在这五种噬菌体展示的肽中，与 EGFR WT 和亲本细胞相比，VLGREEWSTSYW 似乎显示出与 EGFRvIII 细胞的特异性结合，这让人相信噬菌体与其各自靶抗原的细胞表面暴露区域结合。因此，选择该肽进行进一步研究。多序列比对显示该序列与各种蛋白质数据库中任何特征蛋白质的序列没有表现出同源性。这一发现表明 VLGREEWSTSYW 是一种新型肽，可以模拟复杂的表位，这可以解释为什么它不存在于任何数据库中。

对接结果表明，鉴定出的肽靶向人类癌症特异性 EGFRvIII。 EGFRvIII 细胞外结构域结构通过同源建模进行建模。肽的二级结构被预测并停靠在 EGFRvIII 的活性位点上。

通过这一靶向药物基因检测对药物开发的研究，发现当使用过表达 EGFRvIII 或 EGFR WT 的细胞时，与 FALGEA（这是迄今为止报道的唯一 EGFRvIII 选择性肽）相比，VLGREEWSTSYW 肽对 EGFRvIII 细胞的选择性优于对 EGFR WT 细胞的选择性。流式细胞术和 MST 实验表明，尽管在溶液中结合较弱，但 VLGREEWSTSYW 在细胞表面结合实验中表现出更大的亲和力，并证明两种肽都与 EGFRvIII 结合，而它们在溶液中均不特异性结合 EGFR WT

肿瘤基因检测及靶向药物治疗研究关键词：

癌症,特异性,表皮生长因子,酪氨酸激酶,受体,突变变体 III,EGFRvIII,噬菌体展示，新型肽配体

肿瘤靶向药物基因检测的临床前研究结果

肿瘤靶向药物的研究性发现在此报告了使用针对癌症特异性表皮生长因子酪氨酸激酶受体突变变体 III (EGFRvIII) 的噬菌体展示的新型肽配体的选择和表征。这种受体在几种癌症中表达：卵巢癌、乳腺癌和胶质母细胞瘤，但在正常组织中不表达。针对 EGFRvIII 筛选了一个 12 聚体随机肽文库。噬菌体选择的肽通过下一代测序 (NGS) 进行高通量测序，并研究了它们的多样性以鉴定预计与 EGFRvIII 具有最高亲和力的高丰度克隆。对富集的肽进行了表征，并通过流式细胞术分析证实了它们对表达 EGFRvIII、EGFR 野生型 (EGFR WT) 或低内源水平 EGFR WT 的稳定细胞系的结合能力。合成了最佳候选肽 VLGREEWSTSYW，并在体外验证了其对 EGFRvIII 的结合特异性。此外，计算对接分析表明，所鉴定的肽选择性地结合 EGFRvIII。因此，新型 VLGREEWSTSYW 肽是一种很有前途的 EGFRvIII 靶向剂，可用于未来的癌症诊断和治疗应用。

肿瘤靶向药物基因检测研究的重要意义：

表皮生长因子 (EGF) 酪氨酸激酶受体突变变体 III (EGFRvIII)1 是为数不多的已知癌症特异性细胞表面标志物之一。与野生型 EGF 受体 (EGFR WT) 相比，突变受体在细胞外结构域中缺少氨基酸残基 6-273，并且删除这 268 个氨基酸会在氨基酸 5 和 2742 之间产生一个具有新甘氨酸残基的连接位点。 EGFRvIII 不包含配体结合域并且具有组成型活性。

尽管 EGFRvIII 的激酶活性比配体激活的 EGFR WT 弱得多，但发现它足以赋予肿瘤生长优势。 EGFRvIII 存在于许多人类恶性肿瘤中，例如胶质母细胞瘤、肺癌和乳腺癌。 EGFRvIII 是胶质母细胞瘤患者中最常见的 EGFR 突变，在 20-50% 的胶质母细胞瘤中表达。 EGFR WT9 过表达肿瘤患者的患病率最高，EGFRvIII 被认为发生在 EGFR WT11 扩增后。然而，与在大多数小鼠和人类健康细胞中表达的 EGFR WT 不同，EGFRvIII 从未在正常组织中被发现。因此，EGFRvIII 可用作癌症诊断和治疗的靶点，尤其是胶质母细胞瘤。

肿瘤靶向配体如肽和抗体可以有效地帮助将某些细胞毒剂（生物或合成的）递送至肿瘤细胞，从而提高治疗效果，同时限制正常组织暴露于细胞毒剂。治疗方法包括使用非武装单克隆抗体 (MAb) 放射性标记的 MAb15、与免疫毒素偶联的 MAb 或硼化树枝状聚合物。 EGFRvIII 特异的单链可变片段 (scFv) 被发现并整合到串联抗体 (TandAb) 构建体中。选择性识别肿瘤细胞的小肽 (< 5 kDa) 优于 MAb (150 kDa)、TandAb (100 kDa) 和 scFvs (20–30 kDa)，因为它们由于尺寸小得多而易于合成和修饰，具有更高的细胞膜穿透力，并具有较低的免疫原性。即使与抗体和片段相比，肽的结合亲和力较低，但在开发肿瘤靶向递送系统时，可以通过在纳米结构表面掺入多个肽拷贝来提高亲合力。

关于肿瘤成像应用，迄今为止，只有 12 种癌症突变特异性示踪剂获得 FDA 批准，没有一种用于脑肿瘤。肽示踪剂优于抗体示踪剂，因为它们的免疫原性低且成本低（如上所述），而且还因为它们可以从血液和非靶组织中快速清除，注射到成像的时间更短，并且它们与更短的药物相容 -活的同位素。因此，需要开发与 EGFR WT 相比能够以高特异性结合 EGFRvIII 的新肽，用于诊断、治疗或治疗应用——作为使用放射性标记或荧光团标记的显像剂，用于肽-药物偶联物或靶向递送系统 .

现有技术中已经描述了两种用于靶向肿瘤细胞的EGFR的短肽。 FALGEA 肽被描述为结合 EGFR WT 和 EGFRvIII。从 GE11 肽中发现的 YHWYGYTPENVI 肽已被证明可与 EGFR WT 结合，但其与 EGFRvIII 的潜在结合尚不清楚。

这一具体的肿瘤靶向药物基因检测的研究的目的是使用噬菌体展示鉴定与 EGFRvIII 结合的新型肽，这是一种广泛用于开发肽配体的方法。在我们的策略中，该过程涉及三轮亲和力选择和噬菌体扩增的迭代，然后是高通量测序 (HTS)，以分析分离肽的丰度和多样性。筛选的噬菌体展示的肽与蛋白质靶标 EGFRvIII 的结合在细胞上进行了测试，并通过流式细胞术进行了表征。仅合成潜在的命中以确认它们的细胞结合，并通过微尺度热泳 (MST) 和计算对接评估它们的结合亲和力。