【佳学基因-基因检测】简述单分子靶向测序

在过去几年中，第二代测序（NGS）的巨大进步使DNA测序的成本大大降低，尽管如此，人类全基因组测序和生物信息的解读成本依旧很大。第二代测序对全基因组测序和整个外显子测序非常有效，这就需要基于靶向测序方法，也就是说需要在测序前的样本制备过程中，应用目标序列捕获技术，杂交和多重PCR是贼常用的方法。

Yan Gao等发表在《自然》杂志上的研究非常全面的介绍了单分子靶向测序（SMTS），其原理是将靶向捕获和测序结合在一个步骤中，使用高分辨率显微镜，在单分子水平上检测标记在核苷酸上的荧光探针。将目的基因的特异性引物附着在流动池的表面上，通过与流式细胞中的引物杂交进行测序，而不需要利用PCR富集，与第二代利用靶向测序方法相比，单分子靶向测序简化了样品制备的复杂过程，避免了PCR扩增引起的偏差或误差。单分子测序技术提供了一个非常适合癌症基因突变检测、传染病检测、遗传病症筛查和产前诊断的新平台。
 

荧光染料标记核苷酸的选择对于单分子检测也是至关重要的，选择ATTO 647N染料标记核苷酸，对EGFR，KRAS和BRAF基因进行测序，并合成了野生型序列和含有突变与短缺失的两套用于测序的靶向DNA模板，并且在3'末端含有Cy3荧光染料。用532nm绿色激光激发标记Cy3荧光染料，并收集图像以定位靶DNA模板的位置。然后，把利用ATTO647N和DNA聚合酶修饰过的可逆终止子加入到流动池中，重复测序循环，直到达到所需的读取长度。在四次运行中，每个基座的平均替代误差率为0.52％。

单分子靶向测序相对于一代、二代测序优势如下：
 

1、样品制备程序简单快捷；

     2、单分子靶向测序技术成本低；

     3、周转时间和样品处理错误的风险低；  

     4、可直接对原始样品分子序列，而不是PCR扩增产物。

贼近，牛津Nanopore公司发布了他们的测试版本的测序仪，其可能达到超过100,000个碱基对的序列长度。与其他单分子测序技术相比，单分子靶向测序在一个流动池中直接捕获和测序目的基因是有优势的。