加醇沉淀
用醇沉淀的目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来,从而实现核酸与其它杂质–主要是盐的分离。就核酸而言,标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量,但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现,当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后,单独使用醇也可以使核酸沉淀下来;或者含有盐,使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来,这样的话,得率可能会降低。当碰到问题,判断其主要是纯度原因时,有效可以通过调整沉淀条件来改善。
洗涤
洗涤原理与目的: 洗涤是非常重要的,首先一定要将沉淀悬浮起来;第二就是要控制一定的时间,尤其是当核酸沉淀比较大时;第三是少量多次;第四则是去上清要有效。对于质量好的离心管,上清可以去除得非常有效,否则其残留量多到会影响后续的实验。可以通过倒掉液体后再短暂离心,将残液用移液器吸出。
由于残液中都含有上一步操作中的杂质,其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇,杂质是不会被挥发去除的。另外,核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度。沉淀越大,裂解液的裂解能力越强,洗涤越要有效:放置时间相对要长一点,洗涤次数也要考虑增加。当然,乙醇浓度的选择也非常重要,一般情况,洗涤要用室温的 75% 乙醇。
核酸溶解与保存
核酸溶解: DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解,其中原因是有人认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险。如果操作过程控制得当,DNase 的残留几乎是可以忽略的,有效可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。
核酸保存:基本上,核酸在保存中的稳定性,与温度成反比,与浓度成正比。一般在-20℃保存。如果温度不合适,核酸发生降解或者消失,首要原因是酶残留导致的酶解,第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解 ,RNA 在弱酸性更稳定,而 DNA 在弱碱性更合适。
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