【基因解码】粘多糖病Ⅰ型基因矫正的研究和应用

遗传病、罕见病基因检测导读：

基因矫正技术是一种定向基因编辑技术。粘多糖病是一种溶酶体酶代谢性疾病。不同的患者可能具有类似的表型但是具有不同的致病基因。而基因矫正需要通过基因解码正确地发现明确的致病基因位点后，从基因根源上进行矫正治疗的方法。

粘多糖病I型及溶酶体病

溶酶体酶缺乏症是一大类缺乏有效治疗的遗传性疾病。通过基因解码找到明确的致现基因后，通过基因矫正进行治疗是目前非常有潜力的一种治疗方法。在佳学细胞这样的干细胞做为载体的新型技术下，具有正常功能的基因信息被引入体内，高效表达具有功能的蛋白质，从而纠正生化缺陷并阻止疾病进展。本案例描述了一种有效的基因矫正方法，使用2020年诺贝尔奖技术，采用CRISPR-Cas9将溶酶体酶iduronidase靶向人类CD34+造血干细胞和祖细胞的CCR5安全港位点。修饰后的细胞分泌超内源酶水平，维持长期的再增殖和多系分化潜能，并能改善免疫低下小鼠I型粘多糖病模型的生化和表型异常，这些研究为基因组编辑CD34+造血干细胞的开发提供了支持干细胞和祖细胞是治疗粘多糖Ⅰ型的潜在方法。安全港方法为溶酶体酶的表达提供了一个灵活的平台，使其适用于其他溶酶体储存障碍。
 

溶酶体贮存性疾病（LSDs）是由溶酶体蛋白缺乏引起的一大类遗传性疾病，许多缺乏有效的治疗方法。粘多糖症I型（MPSI）是一种常见的LSD，其原因是iduronidase（IDUA）活性不足，导致糖胺聚糖（GAG）积聚和进行性多系统恶化，严重影响神经和肌肉骨骼系统。目前对多发性硬化症的干预措施包括酶替代疗法（ERT）和异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）；这两种疗法的疗效都很有限。ERT不跨越血脑屏障，需要终身治疗，花费昂贵，长期治疗还会产生抑制性抗体可以进一步降低酶替代疗法的效果。Allo-HSCT可以持续提供酶源，组织巨噬细胞能够迁移到受影响的器官，包括大脑，在病变组织提供局部酶活性，比ERT效果更好。但是，对于移植引起的疾病，包括移植后的不可逆性疾病的治疗，包括移植后的并发症，以及移植治疗的不确定性。
 

MPSI的人类和动物研究表明，HSCT的治疗效果可以通过增加循环IDUA水平来提高。在人类中，与来自MPSI杂合子的hspc移植患者相比，非携带者供体移植的患者具有更好的临床反应，并且酶表达降低。在小鼠中，将表达超正常酶水平的病毒转导小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）移植可显著纠正表型。基于此，慢病毒介导的高表达溶酶体酶的HSPCs的自体移植在LSDs（包括严重MPSI）的人体试验中得到了探索(NCT03488394）和异染性白质营养不良。过氧化物酶体疾病X-连锁肾上腺脑白质营养不良也已通过慢病毒转导的自体热休克蛋白成功治疗，尽管缺失酶的超正常表达可能并不重要，因为交叉校正不是该疾病的特征。这种自体方法消除了寻找免疫匹配供体的需要，并减少了同种异体移植的一些潜在并发症。然而，与随机插入病毒基因组、感染性微粒的携带、对某些载体的免疫反应以及可变的转基因表达有关的致瘤性的可能性仍然令人担忧。
 

最近开发的基因组编辑工具将正确的基因添加与基因改变相结合，从而增加治疗效益。其中，聚集规则间隔的短回文重复序列相关蛋白-9核酸酶（CRISPR/Cas9）是最简单的工程化方法，并已成功地用于在培养基中修饰HSPC。该系统通过传递Cas9核酸酶和短引导RNA（sgRNA）被重新用于编辑真核细胞。当靶向由sgRNA确定的序列时，Cas9产生一个双链DNA断裂，从而用设计的供体DNA模板刺激同源重组，该模板包含嵌入在断裂位点中心的同源臂之间的所需基因修饰。这个过程被称为“同源重组介导的基因组编辑”（HR-GE）是最常用的原位基因矫正方法，被誉为治疗单基因疾病的工具。尽管其在LSDs中的治疗潜力仍有待探索，但为了通过在某些LSDs中自体移植转基因HSPCs来最大限度地提高治疗效果，有时功能酶的表达水平必须高于内源性水平。这可以通过将表达盒（感兴趣的外源启动子基因）插入非必要基因组区域（或“安全港”）来实现。
 

安全港提供了一个独立于特定患者突变的平台，易于适应各种溶酶体酶，并且与慢病毒转导相比，由于插入位点受到限制（常染色体中最多2个），因此确保了更可预测和一致的转基因表达。此外，它的破坏对细胞增殖没有影响，也没有已知的致癌转化潜力。

粘多糖病I型的基因矫正研究进展

基因矫正工程师CCR5为靶点，插入一个表达盒，在人CD34+HPSCs及其后代中过度表达IDUA。CCR5被认为是一个非必需基因，因为CCR5的双等位基因失活（CCR5∆32）对人类健康没有普遍的有害影响，CCR5缺失的唯一已知表型是对HIV-1感染的抵抗力和对西尼罗河病毒19的易感性增加。基因矫正工程师报告了人类HSPCs通过基因组编辑来表达CCR5位点的IDUA，并在一个新的免疫受损MSPI模型中改善了疾病的生化、内脏、肌肉骨骼和神经系统表现。

粘多糖I型病的基因矫正安全吗？

为了评估基因毒性和搞清CCR5港脱靶效应，基因矫正工程师使用了基于生物信息学的工具COSMID（CRISPR脱靶位点与错配位点、插入和缺失）。在CB衍生的HSPCs的两个重复实验，用深度测序法测定了共67个可能的脱靶效应位点。在每一个重复实验中，比较了模拟细胞和用RNP电穿孔的细胞与野生型（WT）Cas9或高保真度（HiFi）Cas937所测得的百分比指数。67个位点中有5个位于重复单元内，重复与缺失不能明确到特定的位点。对于剩下的62个基因组位置，如果：（1）该位点的indels百分比大于0.1%（检测限），（2）两个重复样本中存在脱靶效应，以及（3）RNP中的indels高于模拟样本，则认为这些位点是真正的脱靶。根据这些标准，只有四个位点被认为是真正的偏离目标。对于所有这些部位，Indels的频率<0.5%，使用HiFi-Cas9可以有效消除脱靶效应，同时保持了靶向效率。只有一个外显子位点出现在SUOX基因（亚硫酸盐氧化酶）。在该部位测得的最高脱靶比例为0.128%，低于HiFi-Cas9的检测限。这些数据表明，CCR5-sgRNA与WT-Cas9，特别是HiFi-Cas9结合，在生物信息学预测的大屏幕上，其脱靶效应可以忽略不计。

基因矫正的研究表明，在原代细胞中，Cas9介导的DSBs导致p53介导的细胞周期阻滞，从而降低HR-GE的效率。因此，当选择成功接受HR-GE的细胞时，p53阴性克隆的富集潜力引起了人们的关注。为了检测p53在我们的细胞中的功能，我们针对四个生物样本（两个CB和两个PB衍生的）来表达PGK-IDUA-YFP盒，并分离出mock、YFP+（接受HR-GE的细胞）和YFP−（未进行HR-GE的细胞）。因为p53克隆可能是一个罕见的具有生长优势的群体，为了增加检测概率，细胞被允许扩大100-150倍（约2周）。基因矫正工程师首先使用临床验证的下一代测序分析，对所有四个样本的三种情况下的所有TP53外显子（NM_000546.5）进行测序。尽管体外扩增，在HR-GE+细胞中未发现新的TP53序列变异。与此一致，在用DNA双链断裂诱导剂阿霉素、mock、HR-GE+和HR-GE-细胞处理后，当通过流式细胞术检测p53蛋白稳定性和qPCR测量的七个p53靶基因的转录激活时，没有可以辨别的信号。

基因矫正工程师总共进行了200次尸检（101只小鼠用于初次植入，50只用于二次植入，49只用于NSG-IDUAX/X校正研究），在这些尸检中没有发现明显的肿瘤。实现中出现了三个肿瘤样肿块，经组织学检查证实为脓肿。这200只小鼠被移植了9000万经过基因矫正后的人类细胞。考虑到MSPI患者HSCT的中位年龄约为1岁，平均体重为10 Kg，本研究中使用的基因矫正细胞数是正常剂量的两倍（4.5×10⁶ CD34 HSPCs/Kg）。因此，明显缺乏致瘤性和CCR5 sgRNA的低脱靶效应说明该基因矫正方案是安全的。

关于粘多糖病基因矫正的真实应用

基因矫正的临床应用是一个严肃的、充满希望的方法。但是该方法的应用需要患者的理解和配合，同时需要满足监管部门的要求，经过专家的严格审评。请不同的基因病患者关注佳学基因的研究进展，向佳学基因基因矫正研究基金捐助科研经费，积极宣传基因解码和基因矫正知识，共同促进粘多糖基因矫正方案的早日实施。

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