【佳学基因检测】肿瘤医院进行 114 个癌症相关靶向药物基因检测包的应用研究

肿瘤基因检测与靶向用药导读

肿瘤组织的下一代测序（NGS）（即临床测序）可以通过发现有关具有诊断和治疗意义的可操作基因畸变的信息来指导临床管理。在这里，基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组进行了一项基于医院的前瞻性研究（TOP - GEAR项目，第二阶段），以研究通过NGS基因测序后，通过基因解码分析 114 个癌症相关基因（NCC ）的可行性和实用性（基因检测包基因检测）。基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组检查了 230 例（包括 30 多种肿瘤类型）晚期实体瘤，所有这些都与非肿瘤样本相匹配。根据三大癌症中心发布的下一代癌症诊断和治疗中的下一代测序临床实践指南（第 1.0 版），获得了 187 例（81.3%）的基因分析数据，其中 111 例（59.4%）存在可操作、可以采用靶向药物治疗的基因畸变。此后，有 25 例 (13.3%) 病例根据其基因异常接受了分子靶向治疗。这些结果表明肿瘤分析多重基因组检测在肿瘤临床环境中的效用。本研究已在UMIN临床试验注册中心 ( UMIN 000011141) 注册。

肿瘤正确用药基因检测包临床实验关键词：

可操作基因畸变，临床测序，基因检测，保险报销，NCC Oncopanel，可以干预

1、肿瘤靶向用药临床基因检测包简介

在临床环境中，大规模并行下一代测序 (NGS) 能够同时检查 100 多个基因，以检测“可操作”的突变，帮助肿瘤学家诊断和选择涉及分子靶向药物的潜在治疗方案。这种系统被称为“肿瘤分析多重基因面板测试”或更简单的“基因面板测试”。美国临床实验室改进修正案 (CLIA) 认证的实验室已经实施了多种基于 NGS 的基因组测试。例如，纪念斯隆凯特琳癌症中心的科学家实施了 MSK-IMPACT（可操作癌症目标的综合突变分析）测试来检查 348 个基因，并报告说，在 10 000 名接受调查的患者中，37% 的患者至少有 1 个可操作的突变，而 11%在接受 MSK-IMPACT 测试的前 5009 名患者中，随后参加了基因组匹配的临床试验。Foundation Medicine（美国马萨诸塞州剑桥）开发了 FoundationOne CDx 测试来检查 324 个基因和肿瘤突变负荷 (TMB)，是一种新兴的对免疫检查点阻断疗法敏感的生物标志物。这两项测试现已获得 FDA 批准，通过促进保险报销，进一步促进了美国的癌症基因组医学。日本的常规肿瘤学实践中尚未实施基因组检测；即，他们没有得到日本厚生劳动省 (MHLW) 运营的国民保险系统的报销。然而，一些学术机构已经研究了基因检测的可行性和实用性，

基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组一直在进行一项基于医院的前瞻性队列研究，以研究使用国家癌症中心 (NCC) Oncopanel 测试对 114 个癌症相关基因进行基于 NGS 分析的可行性和实用性（表

表格1:NCC Oncopanel 基因检测包中的肿瘤相关基因列表 (n = 114)

所有外显子的突变和拷贝数改变					融合
ABL1	CRKL	IDH2	NF1	RAC2	ALK
ACTN4	CREBBP	IGF1R	NFE2L2/Nrf2	RAD51C	AKT2
AKT1	CTNNB1	IGF2	NOTCH1	RAF1/CRAF	布拉夫
AKT2	CUL3	IL7R	NOTCH2	RB1	ERBB4
AKT3	DDR2	JAK1	NOTCH3	RET	FGFR2
ALK	EGFR	JAK2	NRAS	RHOA	FGFR3
APC	ENO1	JAK3	NRG1	ROS1	NRG1
ARAF	EP300	KDM6A/UTX	NTRK1	SETBP1	NTRK1
ARID1A	ERBB2/HER2	KEAP1	NTRK2	SETD2	NTRK2
ARID2	ERBB3	KIT	NTRK3	SMAD4	PDGFRA
ATM	ERBB4	KRAS	NT5C2	SMARCA4/BRG1	RET
AXIN1	ESR1/ER	MAP2K1/MEK1	PALB2	SMARCB1	ROS1
AXL	EZH2	MAP2K2/MEK2	PBRM1	SMO
BAP1	FBXW7	MAP2K4	PDGFRA	状态3
BARD1	FGFR1	MAP3K1	PDGFRB	STK11/LKB1
BCL2L11/BIM	FGFR2	MAP3K4	PIK3CA	TP53
BRAF	FGFR3	MDM2	PIK3R1	TSC1
BRCA1	FGFR4	MDM4	PIK3R2	VHL
BRCA2	FLT3	MET	POLD1
CCND1	GNA11	MLH1	POLE
CD274/PD-L1	GNAQ	MTOR	PRKCI
CDK4	GNAS	MSH2	PTCH1
CDKN2A	HRAS	MYC	PTEN
CHEK2	IDH1	MYCN	RAC1

在这里，基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组总结了 TOP-GEAR 第二阶段分析的前 230 个案例的结果。结果表明基因组测试在临床肿瘤学环境中的可行性和实用性。从 2018 年 4 月起，日本 50 家癌症基因组医学核心和联络医院（在 Advanced Medical Care B 系统内）对 NCC Oncopanel 测试进行测试，以验证其可行性和实用性。

2. 肿瘤靶向用药基因检测包临床试验患者的选择和数据注方法

2.1. 患者人群

年龄在 16 岁或以上、经组织病理学诊断为实体瘤以及将完成或已经完成标准化疗的患者被纳入 TOP-GEAR 研究 (n = 248)。接下来，检查每个病例中肿瘤细胞含量为 10% 或更高的存档福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 肿瘤组织的可用性（病理学家通过计算每个组织中肿瘤和非肿瘤细胞的细胞核来估计肿瘤细胞含量）；在研究中分析了适当的案例，以解决 NCC Oncopanel 测试 (n = 230) 的可行性和实用性。该研究得到了 NCC 机构审查委员会的批准，所有患者都提供了书面知情同意书，以将基因组和临床数据用于研究目的。征得同意后，患者还被问及是否会分别向治疗医师报告他们的体细胞和生殖系基因改变的结果。在分析的 230 例病例中，分别有 228 例（99.1%）和 219 例（95.2%）同意接受体细胞和生殖系检测结果；因此，结果相应地返回给患者。

2.2. 基于下一代测序的多重基因检测包（NCC Oncopanel 检测）

NCC Oncopanel 检测是一种基于杂交捕获的 NGS 检测，旨在检测 114 个临床或临床前相关基因的整个编码区的突变、扩增和纯合缺失，以及面板中包含的 12 个癌基因的重排（表

2.3. 生物信息学分析

在使用 Cutadapt 程序去除接头序列后，使用 Burrows-Wheeler Aligner 和 Burrows-Wheeler Aligner-Smith-Waterman 算法将 NGS 读数映射到人类参考基因组。根据病理检查定义的肿瘤细胞含量设置基因畸变调用的平均读取深度覆盖的阈值；细胞含量超过 50% 的样本阈值为 200，细胞含量为 20%-50% 的样本为 250，细胞含量低于 20% 的样本为 500。对于平均读数覆盖深度高于这些阈值的样本，使用 cisCall 程序（版本 7.1.5）检测体细胞突变（单核苷酸变异和短插入和缺失 (indels)）、基因扩增、纯合缺失和基因融合.变异等位基因频率大于或等于 5% 的突变和拷贝数增加超过 4 倍的扩增被定义为阳性。拷贝数减少少于 0.5 倍的基因被认为是纯合缺失候选者，并使用 Integrative Genomics Viewer (IGV) 通过人工检查来判断。来自 refGene (20150219)、ensGene (20140406) 和 COSMIC（版本 71）

美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG ) 建议报告偶然或次要发现，GATK 计划检测到

2.4. 可操作的定义

用于药物选择的可操作基因异常是那些预计会赋予已批准靶向药物或目前在临床试验中的实验性靶向药物敏感性/抗性的基因异常。根据下一代测序在癌症诊断和治疗中的临床实践指南（由日本医学肿瘤学会、日本临床肿瘤学会和日本癌症协会发布），为每个基因畸变添加了证据水平。

2.5. 肿瘤突变负担（负荷）

肿瘤突变负担定义为每兆碱基基因组检查的体细胞、编码、碱基替换和插入缺失突变的数量（即突变总数除以 1.38 Mb [NCC Oncopanel 检测覆盖的目标区域的基因组大小] ）。对目标基因编码区的所有碱基替换和插入缺失，包括同义改变进行计数。从肺癌、乳腺癌和卵巢癌 (n = 20) 的肿瘤和非肿瘤组织中提取的 DNA，其 TMB 先前通过全外显子组测序进行了 NCC Oncopanel 分析，以验证其用于估计 TMB 的效用。

2.6. 分子肿瘤基因检测专家组

NCCH 的一个多学科团队在分子肿瘤委员会会议上讨论了可行的基因畸变和可能的治疗方法，该团队称为“专家小组”，每月开会两次。董事会成员包括医学肿瘤学家、儿科肿瘤学家、病理学家、基因组研究人员、生物信息学家和遗传咨询师。委员会成员讨论了基因知情的治疗方案和其他问题，例如病理诊断的授权和体细胞/种系变异的解释。该报告被退回给治疗医生，他们向患者解释了细节。

3. 肿瘤正确用药基因检测包的分析结果

3.1. 测试的可行性

2016 年 5 月至 2017 年 5 月，TOP-GEAR 招募了 248 名患者，并检查了是否有合适的肿瘤组织（图1）

187例包括30多种肿瘤。主要肿瘤类型如图

3.2. 包含可操作基因畸变的病例百分比

在获得基因分析数据的 187 例病例中，有 156 例检测到至少 1 处基因异常（83.4%）（图2）

根据证据级别 1A-3A，109 例（58.2%）至少存在 1 个可操作的基因畸变（图2）

接下来，基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组检查了每种肿瘤类型的病例百分比（图

3.3. 高 TMB 病例的比例

为了检查 NCC Oncopanel 测试评估 TMB 的能力，基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组使用 NCC Oncopanel 测试检查了另外 20 个癌症病例，在这些病例中，在以前的研究中通过全外显子组测序测量了 TMB。然后基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组比较了 2 次测定产生的 TMB 值。NCC Oncopanel 检测产生的 TMB 值（减去相应外周血 DNA 中检测到的种系变异后每兆碱基的体细胞突变数）与全外显子组测序结果显示出强相关性（R 2 = 0.98），表明 NCC Oncopanel 测试比其他基因面板测试更适合作为评估 TMB 的工具（图

下一代测序在癌症诊断和治疗中的临床实践指南中的证据级别 1A-3A对应于分子病理学协会、ACMG、美国临床肿瘤学会和美国学院发布的指南中的证据级别 A-C病理学家。因此，同样比例（即 59.4%）的病例也被判定为基于证据级别 A-C 的异常阳性；即，他们有临床上显着的基因畸变。

3.4. 根据可操作的基因畸变进行药物治疗

截至 2018 年 5 月 31 日，即在最后一个病例入组后约 1 年，根据 NCC Oncopanel 检测检测到的可操作基因异常进行药物治疗。总共有 25 例 (13.4%) 病例根据其确定的基因畸变接受了分子靶向药物（表

表 2：根据可操作基因畸变接受分子靶向治疗的癌症病例（n = 25）

No	TOP-GEAR ID	肿瘤类型	年龄（岁）	性别	绫	罕见的癌症	可操作的基因畸变	药品	药物类型
1	5022	卵巢癌	37	F	是	是	KRAS突变	泛RAF抑制剂	研究药物
2	5025	大肠癌	69	M	n	n	KRAS突变	泛RAF抑制剂	研究药物
3	5010	大肠癌	44	M	n	n	BRAF突变	泛RAF抑制剂	研究药物
4	5058	胰腺癌	47	M	n	n	KRAS突变	泛RAF抑制剂	研究药物
5	5004	胰腺癌	58	F	n	n	KRAS突变	ERK抑制剂	研究药物
6	5054	食管癌	61	M	n	n	FGFR2放大	FGFR2抑制剂	研究药物
7	5017	软组织肉瘤（恶性心脏肿瘤）	28	F	是	是	MDM2放大	HDM2抑制剂	研究药物
8	5130	软组织肉瘤（脂肪肉瘤）	54	F	n	是	MDM2放大	HDM2抑制剂	研究药物
9	5076	非小细胞肺癌	67	M	n	n	肿瘤突变负担高	免疫检查点抑制剂	研究药物
10	5160	非小细胞肺癌	42	M	n	n	肿瘤突变负担高	免疫检查点抑制剂	研究药物
11	5078	非小细胞肺癌	67	F	n	n	CCDC6-RET融合	阿来替尼	研究药物
12	5164	乳腺癌	35	F	是	n	HER2扩增	HER2 ADC	研究药物
13	5215	胆道癌	68	M	n	n	HER2扩增	HER2 ADC	研究药物
14	5227	原发部位不明的肿瘤	65	F	n	是	PIK3CA突变	TORC1/2抑制剂	研究药物
15	5208	大汗腺癌	70	M	n	是	FGFR2-CLIP1融合	FGFR抑制剂	研究药物
16	5060	炎性肌纤维母细胞瘤	51	M	n	是	CLTC-ALK融合	阿来替尼	标签外使用
17	5219	肥大细胞瘤	39	M	是	是	KIT突变	伊马替尼	标签外使用
18	5003	非小细胞肺癌	36	M	是	n	CCDC6-RET融合	乐伐替尼	标签外使用
19	5077	组织细胞肉瘤	18	M	是	是	MAP2K1突变	曲美替尼	标签外使用
20	5098	非小细胞肺癌	46	M	n	n	EML4-ALK融合	阿来替尼	批准的药物
21	5041	非小细胞肺癌	51	F	n	n	EGFR突变 (p.V769_D770insGQR)	阿法替尼	批准的药物
22	5162	非小细胞肺癌	54	F	n	n	EGFR突变 (p.E746_T751delinsI)	阿法替尼	批准的药物
23	5109	非小细胞肺癌	64	F	n	n	EGFR突变 (p.S752_I759del)	吉非替尼	批准的药物
24	5115	非小细胞肺癌	35	M	是	n	CD74-ROS1融合	克唑替尼	批准的药物
25	5071	黑色素瘤	60	M	n	是	肿瘤突变负担高	纳武利尤单抗	批准的药物

ADC，抗体药物偶联物；AYA，青少年和年轻成人（15-39 岁）；F，女；FGFR，成纤维细胞生长因子受体；HDM2，人双分钟2同源物；HER2，人表皮生长因子受体2；男，男；TOP-GEAR，Onco-Panel 的基因分析试验以估计癌症治疗期间的不良事件和反应；TORC1/2，雷帕霉素复合物靶点 1/2；是的，是的；n，没有。

3.5. 基于可操作基因畸变的诊断和预后

使用 NCC Oncopanel 测试的基因分析结果也用于诊断和预后。在 6/187 (3.2%) 名患者中发现了导致遗传性癌症的种系突变（表3)

表3:在接受标准化疗的 6 名实体瘤患者中检测到种系突变

不。	TOP-GEAR ID	肿瘤类型	年龄	性别	基因	种系突变（核苷酸变化，影响）	临床变量	遗传咨询
1	5018	心脏血管肉瘤	38	M	MSH2	c.C1120T, p.Q374X	RCV000076043	完毕
2	5126	卵巢癌	48	F	BRCA1	c.T188A, p.L63X	RCV000077499	完毕
3	5110	卵巢癌	64	F	BRCA1	c.4338_4339insAGAA，p.Q1447 fs*16	–	还没有
4	5158	乳腺癌	36	F	BRCA2	c.5574_5577del, p.I1859 fs	RCV000168442	还没有
5	5019	乳腺癌	61	F	BRCA2	c.517-2A>T，拼接	–	完毕
6	5161	胸腺癌	46	F	TP53	c.833_834insT, p.P278 fs	–	还没有

-，未注册; F，女；M，男；TOP-GEAR，Onco-Panel 的基因分析试验以估计癌症治疗期间的不良事件和反应。

4. 肿瘤靶向用药114基因检测包使用效果分析及共识

在这里，基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组展示了一项前瞻性研究的结果，该研究旨在使用 NCC Oncopanel 测试分析 114 个癌症相关基因。包括生物信息学分析在内的测试是在 NCCH 的质量高效实验室进行的。在分析的 230 例病例中，获得了 187 例（81.3%）的基因分析数据。相应的外周血 DNA 用于正确解决体细胞和种系突变以及 TMB。187 个样本包括日常诊所使用的手术或活检 FFPE 标本，涵盖了 30 多种癌症类型，包括罕见的癌症。大约一半的标本（n = 112, 48.7%）来自日本的医院，而不是 NCCH。成功率与在 CLIA 高效实验室进行的其他基因组测试报告的成功率相似 (80%-85%) 在美国。

在 83.4% 的分析病例中检测到至少 1 个基因异常，59.4% 的病例具有可操作的基因异常，包括高 TMB。这一结果也与美国使用不同基因组测试的前瞻性研究报告的结果相当；这些测试在大约一半的检查病例（40%-60%）中检测到了可操作的基因异常。因此，基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组得出结论，NCC Oncopanel 测试在日本的临床环境中是可行的。测试失败的原因包括低质量/数量的 DNA 和组织交叉污染。在 3.9% 的研究样本中检测到组织交叉污染；这是最近讨论的一个主要的分析前问题。基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组研究的这一比率与最近的一份报告一致，该报告表明，在常规临床测序期间，3% 的病例显示出具有临床意义（即超过 5%）的交叉污染水平。在基因检测包须包含的基因的验证性分析研究小组的研究中，大多数交叉污染的组织样本产生的 DNA 质量差和/或产量低（表

与药物选择相关的可操作基因异常的癌症病例百分比（65.5%）高于肉瘤病例（33.3%）。所有类型肿瘤的这些百分比将在未来通过开发针对当前“不可治疗”改变的药物而增加，例如 SWI/SNF 染色质调节基因中

NCC Oncopanel 测试导致 25 例（13.4%）根据可操作的基因畸变进行药物治疗。其中包括 7 例青少年和年轻成人（15-39 岁）和罕见癌症（表

NCC Oncopanel 测试最近在 MHLW（OncoGuide NCC Oncopanel 系统）的 SAKIGAKE 计划中获得了 PMDA 的批准，并将由国家保险系统报销。实施后，仍将面临若干挑战。首先，癌症基因组数据量每天都在增加；因此，基因畸变在治疗、诊断和预后方面的意义需要不断重新评估。临床肿瘤学家和分子肿瘤委员会成员必须及时了解有关可操作基因畸变和研究药物的信息。日本 NCC 癌症基因组学和高级治疗中心正在建立的癌症知识数据库将有很大帮助（https://www.ncc.go.jp/en/information/2018/0601/index.html）。其次，NCC Oncopanel 检测分析肿瘤和非肿瘤 DNA；因此，将鉴定种系突变。导致遗传病的种系突变存在于一小部分东亚人中。

Cancer Sci

2019 Apr;110(4):1480-1490. doi: 10.1111/cas.13969. Epub 2019 Apr 2.