【佳学基因检测】易栓症基因检测：一个家庭受益的案例

资深临床医师如何看待易栓症基因检测？

血栓症就是高血栓形成倾向。血栓形成倾向是一种多因素疾病，涉及环境因素和遗传因素。通过基因解码所明确的导致血栓形成倾向相关先天性疾病倾向的因素包括抗凝血酶缺乏、蛋白C和蛋白S缺乏、凝血因子V Leiden突变、凝血酶原异常和抗磷脂综合征。心血管疾病致病基因鉴定基因解码揭示了在中国的一个家庭中，编码凝血因子II（即凝血酶）的F2基因突变与血栓形成倾向风险之间的关联，该家庭中有四名成员（I-2、II-2、II-3和III-1）有深静脉血栓栓塞史。致病基因鉴定基因解码通过实验室检测和计算机断层血管造影术对该家庭的疾病进行了评估。为了确定导致血栓形成倾向风险增加的基因原因及该病的遗传力，采用全外显子组测序技术对两名患者（II-2和III-1）进行了分析。在两名受影响个体中分别观察到的2222和2203个遗传变异中，经筛选和Sanger测序确认后，发现了一种外显子错义F2突变T165M（NM_000506:c.C494T:p.T165M;rs5896）。I-2、II-3和III-1与先证者（患者II-2）都具有这一突变，而II-6则为该突变的杂合子形式。在正常对照组中未检测到这种有害突变。本基因检测项目明确了家族成员患病的共同原因，结合生相关生育技术可以阻断该病在家族中的传播。

易栓症的基因解码

易栓症是高度血栓形成倾向。基因解码揭示其是一种血液凝固障碍，以易于形成血栓为特点，并导致不良血栓事件的风险增加，包括深静脉血栓栓塞（DVT）和肺栓塞（PE）。血栓形成倾向的风险因素包括遗传和环境原因。已有的基因解码表明，血栓形成倾向是由蛋白质分化或功能缺陷引起的，包括蛋白质C和S的缺乏，以及已确定的约8种人类基因突变作为致病原因。然而，血栓形成倾向的遗传原因在基因解码的基础上得以进一 步增加。一名52岁的汉族男性因反复性DVT被转诊至佳学基因合作医疗机构，其新颖因DVT住院发生在2001年。经过治疗后，患者康复。2003年，该患者因PE再次入院，并在人民医院置入下腔静脉滤器以防止进一步的PE。通过实验室检测和计算机断层扫描（CT）血管造影术，患者的疾病被诊断为血栓症。分析了可能参与其疾病发生的因素。为了调查可能的潜在原因，采用了全外显子组测序（WES）技术及基因解码来排除疾病发生的基因原因，并鉴定出F2基因的突变。未检测到凝血因子V Leiden突变或凝血酶原G20210A突变。

F2基因位于染色体区域11p11-q12，跨越20.3kb。该基因转录并翻译成凝血因子II，即凝血酶（462个氨基酸），它参与人类血液凝固的贼后阶段并控制凝血酶原的合成。F2突变导致各种形式的血栓形成和凝血酶原异常。

佳学基因检测在患病家族的同意下，招募了一个患有血栓形成倾向的汉族家庭。该家庭包括11名健在成员（包括先证者及受影响个体II-3、III-1），并选取了100名正常的汉族献血者作为对照。正常献血者的年龄范围（35至60岁）和性别比例（50名男性，50名女性）与患有该疾病的II-2、II-3、III-1患者的选择相匹配，且他们的年龄分别为52岁、50岁和32岁。血栓形成倾向的诊断基于典型的临床和实验室测量结果，并通过CT血管造影术（CTA）进行确认。从所有研究参与者中采集抗凝管中的外周血，并按照标准程序，使用酚-氯仿法从家庭成员和正常献血者的白细胞中提取基因组DNA。

图１：受试者的计算机断层扫描血管造影图像。箭头表示下腔静脉滤器。

全外显子组测序（全外显子测序）

利用全外显子组测序（WES）技术对先证者及其儿子（III-1）的DNA进行测序。对约26,000个蛋白质编码基因的外显子进行测序，同时对具有血栓症（血检形成倾向）患者和健康个体的基因突变序列进行比对。使用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0试剂盒（Roche Diagnostics，美国印第安纳波利斯）捕获每个样本的编码序列，并将每个捕获的文库加载到Solexa Hiseq2000平台（Illumina，美国圣地亚哥）上进行序列分析。使用Covaris S2系统（Covaris Inc.，美国马萨诸塞州沃本市）对两名受影响个体的基因组DNA样本进行片段化。然后将DNA Library Prep Reagent Set（New England Biolabs Inc.，美国）中的接头连接到所得片段的两端。通过连接介导的聚合酶链反应（PCR）扩增捕获的片段，随后进行测序。
 

突变序列定位与基因解码分析

参与者的全外显子组测序（WES）是从血液中提取的基因组DNA进行的，并通过佳学基因高通量基因测序及基因解码平对啊进行分析。使用Burrows-Wheeler Aligner将所有的测序的区域定位到与人类参考基因组。使用SOAPsnp软件包和SOAP denovo分别检测合并BAM文件中的单核苷酸多态性（SNP）以及插入或缺失（indels）。（http://www.soap.genomics.org.cn/soapsnp.html）。

候选SNP的筛选与标记

使用以下分析参数对候选SNP进行筛选和标记：i) SNP质量得分大于20；ii) 测序深度不低于4倍；iii) 两个SNP之间的距离大于5个碱基对；iv) 估计的拷贝数小于2。

图2：先证者的计算机断层扫描血管造影图像显示了肝硬化和脾肿大。（红色箭头指示先证者的肝肿块，白色箭头指示脾脏）。

候选基因验证

候选突变通过高通量测序获得后，佳学基因进一步采用诺贝尔获奖技术Sanger测序验证WES的高效性，以确认候选基因的突变。使用的PCR引物为正向5′-TGTGAACATCACCCGGTCAG-3′和反向5′-GACTGACGCCAGCTCTGAAG-3′，设计用于验证T165M基因中的候选突变。结果与WES识别的候选突变一致。此外，还通过以下方法验证了WES结果的高效性：i) 家族内验证，在每个家庭成员的基因组中观察到表型和基因型的共分离突变；ii) 在100名正常献血者中进行验证，确认在正常献血者中未观察到表型和基因型的共分离突变。此外，使用ClustalW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）对凝血因子II的跨物种氨基酸进行了比较。从NCBI数据库中获取F2的氨基酸序列，然后输入到ClustalW2中。ClustalW2的结果显示了所选序列的贼合适匹配，并以一种易于识别和理解的方式对齐了它们的同一性、相似性和差异性。

基因解码结果找到了家族中血栓倾向患者的临床特征

已知增加血栓事件发生风险的遗传因素包括蛋白C和蛋白S缺乏。此外，因子V Leiden和凝血酶原G20210A突变、因子VIII、IX或XI水平升高、同型半胱氨酸和纤维蛋白原也可能是血栓事件的危险因素。通过佳学基因合作医院的实验室检测和CT血管造影，证实了患者的易栓症的临床诊断。分别采用酶联免疫吸附试验、一期凝血试验和单克隆抗因子XI捕获抗体测定因子VIII、IX和XI的水平。采用多克隆酶联免疫吸附试验测定蛋白C和蛋白S，采用STAGO自动凝血仪进行凝血研究。患者的凝血因子及蛋白C和S水平均正常。然而，先证者及其他受累家族成员的纤维蛋白原水平异常。观察到他们的活化部分凝血活酶时间和血浆凝血酶原时间延长。血浆免疫反应性纤维蛋白原水平也较低。
 

全外显子组测序确定F2为候选基因

对先证者及其儿子（II-2和III-1）的外显子组进行了捕获和测序。按照之前描述的测序和过滤步骤后，为两名受累个体确定了候选变异体。总体而言，外显子组实现了高覆盖率，为两名受累个体分别产生了9300万和9900万条测序读段，分别覆盖了73亿和74亿个碱基。其中，约90.7%的读段与人类参考基因组比对成功，60.5%的读段落在靶向和富集的外显子上。靶向外显子的平均测序深度为84倍。在该家族的两名受累个体中，分别鉴定出101,037和97,227个遗传变异，包括非同义突变、剪接受体和剪接供体位点变异以及插入/缺失（indels）。此外，这些II-2和III-1的变异体还通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）dbSNP构建版132（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）、SIFT（http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html.）和PolyPhen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）进行了进一步评估。SIFT和PolyPhen2程序用于蛋白质分析，其应用过程符合之前描述的分析方案。经过这一过滤步骤后，仅在候选区域内发现了一个变异体（NM_000506:c.C494T:p.T165M;rs5896）。该变异体是一个之前在其他汉族人群研究中未被观察到的纯合子错义突变，但在新疆哈萨克族人群中，该变异体被报道为与血栓倾向相关的遗传风险因素。

Sanger测序

为了验证全外显子组测序（WES）的结果，采用Sanger测序分析了该家族中F2基因的候选突变（T165M）。结果显示，Sanger测序进一步证实了候选变异体（T165M）的存在，排除了假阳性的可能性。多方法验证，高效了检测结果的正确性。

图3： 一个患有血栓倾向（thrombophilia）的家族的家系图

T165M的为什么是致病基因？基因解码进一步明确

根据《人体致病基因集及其结构功能分析》，F2的结构与人类凝血酶原相似。受影响的氨基酸（T165M）位于第6外显子，导致第165位氨基酸由苏氨酸突变为甲硫氨酸。先前的研究已揭示，第6外显子及其侧翼区域具有高度多态性。然而，通过ClustalW2将受影响的人、小鼠、猩猩、兔子、大鼠、牛、绵羊、马、猪、热带爪蟾和黑猩猩基因组中的氨基酸序列及其侧翼区域（残基145-185）进行比对，发现T165M位于F2的一个高度保守区域内。进一步说明该基因序列的正常对健康维护的重要性。

易栓症基因检测的重要意义

在易栓症的致病基因查找及其遗传性的分析判定中，采用CT血管造影和临床试验对家族内的血栓倾向进行了诊断。CT血管造影已成为评估深静脉血栓形成（DVT）和肺栓塞（PE）的有用诊断成像方法，且比其他成像方式更为有效，特别是对于纵隔和实质结构的评估。能够可视化先证者体内下腔静脉滤器的位置、脾肿大和肝硬化。实验室测量结果可能表明该家族血栓倾向风险增加的根本原因。值得注意的是，在先证者中未检测到因子V Leiden和凝血酶原G20210A突变。潜在原因可能是血液凝固成分异常，这可能影响凝血酶介导的机制以及凝血和抗凝过程。

易栓症致病基因鉴定基因解码利用全外显子组测序（WES）技术发现了这一家庭可能的F2变异体与血栓倾向潜在分子机制之间的关联，并揭示T165M突变是疾病发生的原因，其遗传性遵循孟德尔遗传规律。基因解码进一步明确，如果家族成员是变异的杂合子基因型不会形成血栓症，而纯合子具有血栓形成高风险。