焦虑症越来越普遍，影响人们的做事能力，降低生活质量。由于缺乏客观测试，焦虑症诊断不足且治疗不理想，导致不良生活事件和/或成瘾。我们努力通过四步法发现焦虑的血液生物标志物。首先，我们在患有精神疾病的个体中使用纵向受试者内设计来发现自我报告的低焦虑和高焦虑状态之间的血液基因表达变化。其次，我们利用该领域的其他证据，使用聚合功能基因组学方法对候选生物标志物列表进行优先排序。第三，我们在具有临床严重焦虑的独立精神病患者队列中验证了从发现和优先排序中获得的顶级生物标志物。第四，我们在另一组独立的精神病患者中测试了这些候选生物标志物的临床效用，即预测焦虑严重程度状态和未来临床恶化（因焦虑而住院）的能力。我们通过个性化方法提高了个体生物标志物的准确性，按性别和诊断分类，尤其是在女性中。总体证据最好的生物标志物是 GAD1、NTRK3、ADRA2A、FZD10、GRK4 和 SLC6A4。最后，我们确定了哪些生物标志物是现有药物（如丙戊酸、ω-3 脂肪酸、氟西汀、锂、舍曲林、苯二氮卓类药物和氯胺酮）的靶点，因此可用于将患者与药物进行匹配并测量对治疗的反应。我们还使用我们的生物标志物基因表达特征来识别可以重新用于治疗焦虑的药物，如雌二醇、吡仑哌隆、洛哌丁胺和丙吡胺。鉴于未经治疗的焦虑的有害影响、目前缺乏指导治疗的客观措施以及现有基于苯二氮卓类的焦虑药物的成瘾潜力，迫切需要更精确和个性化的方法，就像我们开发的这种方法一样。
主题词：遗传学、生物标志物
介绍
“人们担心的并不是现实问题，而是自己想象出来的对现实问题的焦虑。”
— 爱比克泰德
焦虑是指在预期发生被认为具有潜在危害、难以承受或具有挑战性的事件时反应增强。由于不良的生活轨迹，精神病患者的焦虑情绪可能会增加，焦虑的原因也会增加。因此，他们可能是一个高产人群，我们可以从中尝试识别出可推广和跨诊断的焦虑血液生物标志物。此类标志物将消除评估的主观性，提供一些风险指示，并有助于指导治疗 [ 1 ]。首先，我们在患有精神疾病的个体中采用了强有力的纵向受试者内设计，以发现自我报告的低焦虑状态和高焦虑状态之间的血液基因表达变化，并通过我们开发的视觉模拟量表——简化焦虑量表 (SAS-4) 进行测量，该量表与我们之前发布的简化情绪量表 (SMS-7) [ 2 ] 类似。第二，我们采用类似贝叶斯的聚合功能基因组学方法对候选生物标志物列表进行优先排序，全面整合了我们和其他机构在该领域先前的人类和动物模型证据。第三，我们在一组临床上严重焦虑的精神病患者中验证了我们通过发现和优先排序确定的顶级生物标志物。我们优先列出了 95 个候选生物标志物，这些标志物在前三个步骤中具有最多的证据。第四，我们在另一组独立的精神病患者中测试了这些候选生物标志物是否能够预测焦虑严重程度状态和未来的临床恶化（以焦虑为主要原因的住院治疗）。我们对测试队列中的所有受试者进行了生物标志物测试，并以更个性化的方式根据性别和精神病诊断进行了测试，结果显示个性化方法的准确性更高，尤其是在女性中。第五，我们分析了生物标志物所涉及的生物途径和网络，以及我们的哪些顶级生物标志物有证据表明与其他精神疾病和相关疾病有关。第六，我们确定了哪些生物标记物是现有药物的靶点，因此可用于患者与治疗的药物基因组学匹配，并测量治疗反应。我们还使用顶级生物标记物基因表达特征来识别用于其他适应症的现有药物以及可用于治疗焦虑症的天然化合物。
目前治疗焦虑症的药物（例如 SSRI、SNRI、苯二氮卓类药物、抗组胺药等）并非对每个人都有效（例如反应/缓解率低、反复试验的处方、副作用问题等）[ 3 ]。利用生物标志物谱将合适的患者与合适的药物相匹配是我们工作的一个关键可行成果。
材料和方法
群组
我们的研究采用了 3 个独立队列：发现（状态焦虑发生变化的严重精神疾病）、验证（临床上严重焦虑的严重精神疾病）和测试（用于预测状态焦虑和预测特质焦虑（以焦虑为主要原因的未来住院）的独立严重精神疾病队列）（图 1A）。
图 1. 步骤 1-3：发现、确定优先次序和验证焦虑的生物标志物。
A研究中使用的队列，描述了发现流程、优先排序、每个步骤的生物标志物验证和独立测试队列。B发现队列纵向受试者内分析。Phchp### 是每个受试者的研究 ID。V# 表示访问次数。红色表示高焦虑访问，蓝色表示低焦虑访问。C收敛功能基因组学证据。D在验证步骤中，使用方差分析评估生物标志物的逐步变化，从焦虑程度严重的验证组到焦虑程度高的受试者、焦虑程度低的受试者的发现组，再到焦虑程度严重的验证组。N = 测试访问次数。直方图描绘了验证中增加的生物标志物和减少的生物标志物。E每个步骤的评分。发现探针组是根据其追踪焦虑的得分来确定的，最高分为 6 分（33%（2 分）、50%（4 分）和 80%（6 分））。使用 CFG 确定优先顺序，以确定先前是否有患焦虑症的证据。在优先顺序步骤中，使用 Affymetrix 注释和 GeneCards 将探针组转换为其相关基因。使用 CFG 确定基因的优先顺序，并根据焦虑证据对其进行评分，最高分为 12 分。在内部和外部总分最高为 18 分的情况下，得分至少为 6 分的基因将进入验证步骤。在临床上严重焦虑的精神病患者独立队列中进行验证（STAI 状态 ≥ 55 和 SAS-4 > =60）。四种生物标志物名义上显著，57 种生物标志物逐步改变。我们选择了独立队列中的最佳候选生物标志物进行进一步测试，前 3 个步骤（CFE3）后的总得分为 8 分及以上（n = 95 种生物标志物）。
精神病受试者是我们持续收集的大型纵向成人队列的一部分 [ 4 – 6 ]。受试者是从印第安纳波利斯退伍军人医疗中心的患者群体中招募的。所有受试者均了解并签署了知情同意书，其中详细说明了研究目标、程序、注意事项和保障措施，符合 IRB 批准的方案。受试者在每次测试访问时完成诊断评估和广泛的结构化神经心理学测试，间隔 3-6 个月或每次发生新的精神病住院时。在每次测试访问中，他们都会收到一系列评分量表，包括自我报告视觉模拟量表（1-100），用于定量评估特定时刻的状态焦虑（简化焦虑量表 - SAS-4）。这个 4 项量表着眼于整体焦虑以及恐惧、愤怒和不确定性。每个项目的 VAS 都是 0 到 100，与该时刻相关。因此，它可以生成时间、定量和有针对性的数据。
每次测试时，我们都将全血（10 毫升）收集到两个 RNA 稳定 PAXgene 管中，并贴上匿名 ID 号，然后存放在 −80 °C 的封闭式冰箱中，以备后续处理。从 PAXgene 管中提取全血 RNA 用于微阵列基因表达研究，详情如下。
在本研究中，我们的受试者内发现队列由 58 名受试者（41 名男性、17 名女性）组成，他们接受过多次测试，每个人的焦虑状态在一次测试访问与另一次测试访问之间都至少发生了一次从低焦虑状态（SAS-4 得分 ≤ 40/100）到高焦虑状态（SAS-4 得分 ≥ 60/100）或反之亦然的显著变化（图 1A、B和S1）。其中 2 名受试者各接受 5 次测试访问，3 名受试者各接受 4 次测试访问，21 名受试者各接受 3 次测试访问，32 名受试者各接受 2 次测试访问，因此共收集了 149 个血液样本用于后续的基因表达微阵列研究（图 1A、B和表 S1）。
我们的独立验证队列包括 40 名患有临床重度焦虑症（SAS-4 评分≥60，且一致的高焦虑 STAI 状态评分≥55）的受试者（32 名男性和 8 名女性）（表 S1），其中最热门的候选生物标志物发现被证实在表达上发生了更大的变化。
为了测试生物标志物，我们使用了独立的测试队列。
对于状态预测，我们预测了高焦虑状态（SAS-4 ≥ 60）（161 名男性和 36 名女性受试者）和临床重度焦虑（STAI ≥ 55）（159 名男性和 36 名女性受试者）（图 1和表 S1）。
为了预测未来因焦虑而住院的 特质（图1和 S1表），我们使用了独立测试队列的一个子集，并对其进行了电子病历的纵向跟踪。受试者随后因焦虑而住院的次数是根据电子病历制成表格的。
药物
我们研究中的受试者均被诊断患有各种精神疾病（表 S1），并患有各种合并症。他们的药物列在他们的电子病历中，并在每次测试访问时由我们记录下来。药物会对基因表达产生很大的影响。然而，没有任何特定类型的药物具有一致的模式。我们的受试者服用了各种不同的药物，包括精神类和非精神类药物。此外，独立验证和测试队列的基因表达数据在合并之前按性别和诊断进行了 Z 分数，以对任何此类影响进行标准化。一些受试者可能不遵守治疗，并且他们的医疗记录中可能没有反映出药物或滥用药物的变化。我们的目标是找到追踪焦虑的生物标志物，无论其原因是内部生物学还是由外部药物或药物驱动。事实上，正如我们在本文中所展示的那样，人们会期望其中一些生物标志物成为药物的目标。此外，在发现步骤之后进行的优先排序步骤是基于与文献的领域范围的融合，其中包括与药物效果无关的遗传数据和动物模型数据。总体而言，在我们的设计中，尽管受试者的性别、诊断、服用的药物和其他变量不同，但仍可以通过在独立的生物标志物队列中进行测试来发现、验证和复制。
血液基因表达实验
RNA提取
通过常规静脉穿刺将全血（2.5 毫升）收集到每个 PaxGene 管中。PaxGene 管含有用于稳定 RNA 的专有试剂。总 RNA 的提取和处理如前所述 [ 4 – 6 ]。
微阵列
值得注意的是，所有基因组数据在合并和分析之前都根据性别和精神病诊断进行了标准化（RMA 用于技术变异性，z 分数用于生物变异性）。
有关“材料和方法”其余部分，请参阅补充信息。
结果
在步骤 1 发现中，我们确定了候选血液基因表达生物标志物，这些标志物：1. 在自我报告的低焦虑和高焦虑状态之间血液表达的变化，2. 跟踪受试者在多次访视中的焦虑状态，以及 3. 跟踪多名受试者的焦虑状态。我们使用了焦虑状态的视觉模拟测量 (SAS-4)。在表型水平上，SAS-4 量化特定时刻的焦虑状态，并对每个受试者的焦虑测量值进行标准化，将其与受试者经历过的最低和最高焦虑进行比较（图 S1 ）。它 与当前焦虑状态临床量表（STAI 状态，图 S2）具有中度至强相关性（R = 0.67，p < 0.0001）。
我们对一组纵向随访的受试者（ n = 58 名受试者，149 次随访）进行了强有力的受试者内和跨受试者设计 ，这些受试者在至少两次连续的测试随访之间表现出至少 50% 的变化（从 40/100 以下到 60/100 以上），以确定追踪焦虑状态的差异表达基因。使用我们 33% 的最大原始分数阈值（内部分数为 2 分）[ 5,6 ] ，我们从 Affymetrix 缺失/存在 (AP) 分析和差异表达 (DE) 分析中确定了 10,573 个独特探针组（对应 7195 个独特基因）（图 1D）。这些被带入优先级排序步骤。这代表 Affymetrix 阵列上的 54,625 个探针组富集了大约五倍。
在第 2 步优先排序中，我们使用了聚合功能基因组学 (CFG) 方法对在发现步骤中确定的候选生物标记物进行优先排序（33% 截止值，内部评分≥2 分），方法是使用先前发表的来自人类和动物模型研究的与焦虑症有关的文献证据（遗传、基因表达和蛋白质组学）（图 1E和表 S2）。有 284 个探针组（对应 238 个独特基因）的总分（结合发现分数和优先排序 CFG 分数）为 6 分及以上。这些被带入验证步骤。这代表 Affymetrix 阵列上探针组的富集率约为十倍。
在第 3 步验证中，我们 通过评估哪些标记物的表达从发现队列中的低焦虑到发现队列中的高焦虑再到验证队列中的临床严重焦虑，验证了临床严重焦虑变化的优先候选生物标记物，该验证是在人口统计学匹配队列中 （ n = 40 临床严重焦虑）进行的（图1）。在优先排序步骤后的 284 个探针组中，224 个探针组没有逐步变化，57 个探针组逐步变化。其中，四个探针组（对应四个独特基因）名义上显著。
将前三个步骤的得分添加到总体收敛功能证据 (CFE) 得分中（图 1），我们最终得到了 95 个候选生物标志物（n = 82 个基因，95 个探针组）的列表，它们的 CFE3 得分 ≥8，等于或优于前三个步骤后最高可能得分 24 的 33%，我们决定将其用作经验截止值。这代表 Affymetrix 阵列上探针组的富集率超过 500 倍。这 95 个候选生物标志物被带入分析中，以了解生物学基础。在步骤 4 中，还对它们在其他独立队列中进行了临床效用/预测能力测试（图 2和表 1）。
图2.焦虑、状态和特质的最佳单一生物标志物预测指标。
来自步骤 1-3（发现、优先排序、验证-粗体）之后的顶级候选生物标志物（n = 95）。条形图显示每组中最佳的预测生物标志物。所有带 * 的标志物均具有名义显著性p < 0.05。图表下方的表格显示了每组中 ROC AUC p值（A – C）和 Cox 优势比p值（D）至少具有名义显著性的生物标志物的实际数量。图表中缺失了一些性别和诊断组，因为他们没有任何显著的生物标志物，或者队列太小，按性别-dx 进行 z 评分的数据有限。横断面基于一次访问的水平。纵向基于多次访问的水平（整合最近一次访问的水平、最高水平、最近一次访问的斜率和最大斜率）。分割线代表测试在偶然水平（白色）下的临界值，以及在基于横断面（灰色）和纵向（黑色）的预测中与所有受试者的最佳生物标记处于同一水平的临界值。生物标记的表现优于偶然性。当根据性别和诊断进行个性化时，生物标记的表现会更好。* 名义上显著。** 经 Bonferroni 校正后，候选生物标记的数量得以测试。
表 1.
主要焦虑生物标志物：收敛功能证据 (CFE)。
生物学理解
生物途径
我们使用焦虑症的顶级候选生物标志物列表（n = 82 个基因，95 个探针组）进行了生物通路分析，结果表明 Hippo 信号通路和 CREB 信号通路参与其中（表 2）。使用 DAVID 进行通路分析确定的顶级疾病是抑郁症、酒精消费和注意力缺陷障碍/品行障碍/对立违抗性障碍，指出了共病问题，而 Ingenuity 确定神经系统疾病、机体损伤和癌症是顶级医学共病。
表 2.
焦虑生物标志物的生物学。顶级 CFE3 ≥8（n = 95 个探针组，82 个基因）。
网络与互动
我们对最有希望的生物标志物进行了 STRING 分析（图 S4），揭示了相互作用的蛋白质组。具体来说，HTR2A 位于包含 GAD1、GABBR1 和 SLC6A4（血清素转运蛋白）的网络与以 PIK3R1 为中心的网络（还包含 CCKBR 和 IGFR1）的重叠部分。第三个网络包括 DLGAP1、DYNLL2 和 PTPRD。这些网络可能具有生物学意义，可以作为治疗靶点。第一个网络可能与反应性有关，包含当前标准焦虑治疗（即血清素再摄取抑制剂和苯二氮卓类药物）所针对的基因。第二个网络可能与活动有关，包含与神经营养功能有关的基因。第三个网络可能与连接性有关，包含与突触结构和功能有关的基因。
临床实用性测试
在第 4 步测试中，我们在独立于用于发现或验证的队列中检查了 95 个候选生物标志物是否可以评估高焦虑状态（n = 197 名受试者，495 次就诊）、临床焦虑状态（n = 195 名受试者，486 次就诊），以及预测未来因焦虑而住院精神病治疗（n = 130 名受试者，318 次就诊）（图 2和表 1），使用我们研究对象的电子医疗记录随访数据（分析时距初次就诊长达 14.74 年）（图 1，表 S1）。在合并不同的人口统计组之前，对测试队列中的基因表达数据进行了跨性别和各种精神病诊断的标准化（Z 分数）。我们使用横断面生物标志物水平信息作为预测因子，并使用了多次就诊时生物标志物水平的扩展纵向信息。我们对独立测试队列中的所有受试者的生物标志物进行了测试，并根据性别和精神病诊断以更加个性化的方式进行了测试。
对于独立测试队列中所有受试者的高焦虑状态评估，最佳生物标志物是 ERCC6L2，在高焦虑症中表达降低， 横截面积AUC 为 68% ( p = 0.004)，纵向 AUC 为 69% ( p = 0.03)（图 2A ）。它 在男性中的横截面积AUC 为 72% ( p = 0.003)， 在男性躁郁症患者中的横截面积AUC 为 76% ( p = 0.02)。对于患有抑郁症的男性的临床焦虑，ERCC6L2 的纵向 AUC 也为 100% ( p = 0.0007)。ERCC6L2（ERCC 切除修复 6 样 2）是一种焦虑症的新基因，先前的文献中没有与其相关的证据。ERCC6L2 是 Snf2 家族解旋酶样蛋白的成员。编码的蛋白质可能在线粒体功能和 DNA 修复中发挥作用。反应性和修复可能是焦虑的关键功能 [ 8 ]。
对于独立测试队列中的临床焦虑状态评估，在我们的研究中，SLC6A2 在高度焦虑中表达增加，在所有受试者中 AUC 为 63% ( p = 0.02)，在女性中为 76% ( p = 0.0005)，对所有 95 种测试的生物标志物进行了 Bonferroni 校正。它还具有预测男性精神分裂症患者未来因焦虑而住院的所有 Cox 回归比值比 (OR) 9.02 ( p = 0.0004)，具有 Bonferroni 显著性。SLC6A2（溶质载体家族 6 成员 2）是去甲肾上腺素转运蛋白。我们的另一项研究发现，单独使用阻断该转运蛋白的药物或与阻断 SLC6A4（溶质载体家族 6 成员 4，血清素转运蛋白）相结合的药物，在高度焦虑症中表达也有所增加，已被证明对焦虑症有临床治疗作用 [ 9 ]。
SLC6A4 是本研究重现的先前众所周知的基因的一个例子，尽管证据较弱。对于独立测试队列中所有因焦虑而住院的患者，SLC6A4 在高度焦虑中表达增加，在所有受试者中的 OR 为 1.21（p = 0.01）。在 PTSD 中，其 OR 为 2.54（p = 0.03）。该基因的产物是血清素转运蛋白，它是血清素再摄取抑制剂的靶标，用于治疗压力障碍、焦虑以及抑郁症，这些疾病高度相关且共病。
我们还测试了 95 种候选生物标记物，这些标记物显示出协同效应（优于任何单个生物标记物），可用于预测特征。该标记物（BioM-95）是所有患者未来因焦虑住院的最佳预测指标（Cox 回归 OR 为 2.42，p = 0.02），甚至在男性（OR 为 2.69，p = 0.015）和患有精神病的男性（OR 为 3.36，p = 0.016）中也是更好的预测指标。有趣的是，这也比标准临床测量 STAI Trait 更好（OR 为 1.4，p = 0.043）。
聚合功能证据（CFE）
对于最有可能的候选生物标志物（n = 95），我们将发现（最高 6 分）、CFG 优先级（最高 12 分）、验证（最高 6 分）和测试（状态高度焦虑、状态临床焦虑、第一年住院焦虑特质、未来所有住院焦虑特质 - 如果对所有受试者都有显著预测作用，则每种情况最高可得 3 分，如果在性别上可得 2 分，如果在性别/诊断上可得 1 分）的所有证据计算为 CFE 分数。总分最高可达 36 分：24 分来自我们自己的新数据，12 分来自用于 CFG 的文献数据。我们对新数据的权重高于文献数据，因为它在三个独立队列（发现、验证、测试）中与焦虑具有功能相关性。我们的目标是，根据我们的全部数据和迄今为止该领域的证据，突出具有全面证据的生物标志物：追踪焦虑、具有与焦虑症有关的汇聚证据，并预测焦虑状态和未来临床事件（表 1）。
在所有四个步骤之后（表1 ） ，用于跟踪和预测焦虑症的总体 CFE 最强的 顶级血液生物标志物（n = 19 个探针组，18 个基因）按 CFE4 评分顺序为：GAD1（谷氨酸脱羧酶 1）、NTRK3（神经营养受体酪氨酸激酶 3）、ADRA2A（肾上腺素受体 α 2A）、FZD10（卷曲类受体 10）、GRK4（G 蛋白偶联受体激酶 4）、ATP1B2（ATPase Na + / K + 转运亚基 β 2）、CLIC6（氯离子细胞内通道 6）、EFNA5（Ephrin A5）、GPX7（谷胱甘肽过氧化物酶 7）、同样是 NTRK3（神经营养受体酪氨酸激酶 3）、SLC6A2（溶质载体家族 6 成员 2）， SLC6A4（溶质载体家族 6 成员 4）、TMEM138（跨膜蛋白 138）、ANKRD28（锚蛋白重复结构域 28）、CCKBR（胆囊收缩素 B 受体）、DYNLL2（运动蛋白轻链 LC8-类型 2）、Hs.550187、NRG1（神经调节蛋白 1）和 TFRC（转铁蛋白受体）。
GAD1（谷氨酸脱羧酶 1）是本研究中焦虑的总体首要生物标志物，它从谷氨酸合成 γ-氨基丁酸 (GABA)。已在患有情绪障碍和焦虑症的受试者中观察到 GABA 神经递质系统异常。GAD1 在焦虑和恐慌症中具有先前的遗传证据 [ 10 ]。在我们的研究中，它在高度焦虑时的血液中表达增加。该基因之前已被描述为在恐慌症患者中低甲基化，这与该基因的较高表达相一致 [ 11,12 ]。在我们的研究中，GAD1 适度预测独立测试队列中所有患者的临床严重焦虑状态（AUC 58％，p = 0.04），女性的结果略好一些（AUC 65％，p = 0.03）。它还可以预测所有人未来因焦虑而住院的情况（OR 1.3，p = 0.005）。
疗法
药物基因组学
只有一个顶级生物标志物 DYNLL2 有证据表明苯二氮卓类药物会以与高度焦虑相反的方向调节它；其他的则没有，这很有趣且具有临床用途，因为它带来了其他非成瘾性的选择。
总体而言，根据与焦虑相反方向表达的生物标志物数量，丙戊酸 (33%) 在治疗焦虑症方面具有最佳的广泛疗效证据（表 3A），其次是 omega-3 脂肪酸 (28%)。另一种匹配率最高的替代疗法是 EEG 伽马波段频率 (17%)，冥想和其他正念练习可提高该频率。接下来是锂 (11%) 和氟西汀 (11%)，苯二氮卓类药物 (6%) 的匹配率较低。omega-3 脂肪酸和冥想可能是一种广泛使用的预防性治疗方法，副作用极小，包括对怀孕或可能怀孕的女性。
表 3.
疗法。
A目前治疗焦虑症的最佳方法 通过与表 1中的顶级生物标志物相匹配( n = 19 )。另 见表 S4。B.使用连接图 [ 28 ] (CMAP) 对表 1中的顶级生物标志物( n = 19 ) 中的焦虑症药物进行再利用。高度焦虑 时的表达方向。用于 CMAP 的阵列 HG-U133A 中存在 4 个探针组中有 2 个减少，15 个探针组中有 10 个增加（来自基因 ADRA2A、ATP1B2、CCKBR、FZD10、GAD1、GPX7、GRK4、NRG1、NTRK3、SLC6A2、TFRC）。与基因表达特征具有相反基因表达影响的药物。
目前，许多用于治疗情感障碍和自杀倾向的临床药物会调节多种顶级生物标志物，例如锂（GAD1、ATP1B2、NRG1）、营养 Omega-3 脂肪酸（GAD1、CLIC6、EFNA5、SLC6A4）和抗抑郁药（ADRA2A、FZD10、GPX7、SLC6A2、SLC6A4、TMEM138）（表 1和S4）。这在药物基因组学方法中具有潜在用途，可用于为焦虑和自杀患者匹配正确的药物，并监测治疗反应。
新药研发/再利用
使用一组高度焦虑的顶级生物标志物的基因表达特征进行生物信息学分析（表 3B），发现了焦虑症的新潜在疗法，例如女性性激素雌二醇、5-HT2A 受体拮抗剂吡仑哌隆、外周阿片类受体激动剂洛哌丁胺和抗心律失常药双异丙吡胺。有趣的是，ESR1（雌激素受体 1）是最近一项独立 GWAS 研究中最重要的基因发现之一 [ 13 ]。
讨论
我们描述了一种新颖而全面的努力，旨在发现和验证与焦虑相关的血液生物标记物，包括在独立队列中测试它们以评估预测能力和临床效用。这些生物标记物还为了解焦虑症的生物学打开了一扇窗户，并指明了新的、更精确的治疗方法。
当前临床实践和生物标志物的需求
在临床实践中，评估一个人的内在主观感受和想法，以及对行动和行为进行更客观的外部评分，用于评估焦虑和诊断临床焦虑症，如惊恐发作和广泛性焦虑症。这种方法是不够的，而且落后于其他医学专业使用的方法。此外，从发病到诊断有 9 至 23 年的延迟[ 14 ]。与焦虑相关的血液生物标志物将提供重要的客观测量，为临床评估和治疗决策提供参考。
生物标志物的优势
血液生物标志物具有现实世界的临床实践优势。由于活体个体的大脑无法轻易进行活检，而且脑脊液比血液更难获取，多年来我们一直致力于识别神经精神疾病的血液生物标志物。全血方法便于现场部署样本采集。基因表达变化的评估侧重于我们对免疫细胞的方法。识别反映大脑活动的外周基因表达变化的能力可能是由于大脑和免疫系统具有发育共性，以共同的反应性和随之而来的基因表达模式为标志。大脑和免疫系统之间也存在双向相互作用。并非所有外周细胞表达的变化都反映或与大脑活动有关。通过在发现步骤中使用我们的受试者内设计仔细跟踪表型，然后使用收敛功能基因组学优先级，我们能够提取跟踪并与所研究的大脑活动相关的外周变化，在本例中是焦虑状态及其疾病。
随后在独立队列中进行验证和测试，将名单缩小到最佳标记。最终，我们并不期望在血液中重现大脑中发生的所有事情。我们只是希望有良好的可访问的外周生物标记——在癌症中被称为“液体活检”。
全面性
在当前的研究中，我们对患有严重精神疾病的男性和女性受试者进行了广泛的血液基因表达研究，这个群体在焦虑症的共病率和焦虑的多变性方面非常丰富。事实上，除了他们的主要临床诊断外，总体而言，我们研究中超过 20% 的受试者同时患有临床焦虑症，其中最高比例（37.3%）是那些以重度抑郁障碍 (MDD) 为主要诊断的人（表 S1B）。其他精神疾病和焦虑症之间潜在的分子水平共病性因以下事实而凸显：其他疾病的药物（抗抑郁药、情绪稳定剂，甚至抗精神病药）也用于治疗 PTSD 和焦虑症。我们的主要目标是发现和验证跨诊断的焦虑生物标志物。其次，我们旨在了解它们的普遍性与性别和精神病诊断的特殊性。
我们的研究是分步进行的。首先，我们尝试使用纵向设计来发现焦虑的血液基因表达生物标志物，观察患有严重精神疾病（躁郁症、重度抑郁症、精神分裂症/分裂情感性障碍和创伤后应激障碍 (PTSD)）的男性和女性受试者血液中基因的差异表达，这些高危人群容易出现焦虑，这构成了一个丰富的库，可供寻找生物标志物。我们使用强大的受试者内设计 [ 4 – 6 , 15 ] 将低焦虑状态与高焦虑状态进行比较，以生成差异表达基因列表。其次，我们使用全面的聚合功能基因组学 (CFG) 方法，结合该领域的全部知识，从与焦虑相关的差异表达基因/生物标志物列表中进行优先排序。 CFG 整合了多条独立的证据线——来自大脑和外周、人类和动物模型研究的遗传、基因表达和蛋白质数据，作为一种识别和优先排序发现的贝叶斯策略，减少了每种方法中固有的假阳性和假阴性。第三，我们检查了我们确定的用于跟踪焦虑状态的顶级生物标志物的表达水平是否在来自临床严重焦虑症的独立受试者队列的血液样本中发生了更强烈的变化，以验证这些生物标志物。第四，在相应的独立精神病患者队列中测试了这样发现、优先排序和验证的生物标志物。第五，我们使用生物标志物与现有的精神科药物相匹配，并使用生物信息学分析识别和潜在地重新利用新药来治疗焦虑症。这一系列研究是一种系统而全面的方法，旨在推动该领域向精准医学迈进。
力量
我们采用了系统的发现、优先排序、验证和测试方法，就像我们多年来在其他疾病方面所做的那样[ 2、7、16-18 ]。对于发现，我们使用了一种难以实现但功能强大的受试者内设计，N为58名受试者，共访问149次。受试者内设计排除了遗传变异以及一些药物、生活方式和人口统计学对基因表达的影响，允许在 N 小至 1 15 的情况下识别相关信号。受试者内设计的另一个好处可能是精神症状（“苯丙胺表达”）自我报告的准确性/一致性，因为是同一个人报告不同的状态。这与它在基因表达中提供的信号检测优势在原理上类似。
根据我们在遗传学和基因表达领域超过二十年的工作，以及该领域其他人的研究成果，我们估计使用定量表型比使用分类诊断的效力高出 1 个数量级。通过排除所有遗传和一些环境变异，受试者内纵向设计比受试者间病例对照横断面设计高出 3 个数量级。此外，通过整合许多 SNP 和环境的影响，基因表达比遗传研究高出 3 个数量级。综合起来，我们的方法可能比 GWAS 研究高出 6 个数量级，甚至在 CFG 基于文献的优先排序步骤之前，该步骤涵盖了我们研究之前该领域的所有独立工作，这些工作可能加起来也高出 1 个数量级。此外，验证和测试步骤各自增加了 1 个数量级的额外功率。因此，我们的方法检测信号的效力可能比 GWAS 中使用的大多数当前遗传研究设计高出 10 个数量级。
可重复性
我们在动物模型中重现并扩展了我们早期的研究结果，发现 GABBR1、CCKBR 和 DYNLL2 [ 8 ] 是与焦虑有关的首要基因。
此外，我们的分析完成后，其他独立的大规模研究得出的结果也具有可重复性，因此未纳入我们的 CFG 方法。他们的许多重要发现都出现在我们的焦虑候选基因表达生物标志物列表中，这些发现在我们最初的全基因组、无偏见的受试者内发现步骤中，在任何 CFG 文献优先级排序之前就已经存在了：英国生物银行研究中 10 个终生焦虑症基因中的 2 个 [ 19 ]，百万退伍军人计划研究中 11 个焦虑基因中的 6 个 [ 13 ]，以及代际创伤研究中 42 个前血液生物标志物中的 13 个 [ 20 ]（见补充信息-可重复性文件）。我们的研究与其他基因和基因表达研究（这些研究是在独立队列中采用独立方法进行的）之间的研究结果具有独立可重复性，这令人放心，并为我们的方法和他们的方法的有效性和相关性提供了强有力的聚合证据。我们的工作还为他们的一些顶级基因研究提供了功能证据。
病理生理
我们发现的许多最佳候选生物标志物具有与信号传导相关的生物学作用，特别是 cAMP 和 CREB 信号传导减弱（表 2）。这重现了我们十多年前在焦虑动物模型研究中得出的主要结论之一 [ 8 ]。多动症、自闭症谱系障碍和脆性 X 综合征也报告了 cAMP 信号传导减弱。这为焦虑与注意力和记忆力紊乱之间的流行病学数据以及这些疾病之间的临床共病提供了分子基础。它还表明，增加 cAMP 活性的药物（如兴奋剂 [ 21 ]）以及锂、谷氨酸拮抗剂（如镁）和 PDE-4 抑制剂（如咯利普兰 [ 22 ]）可能有助于治疗焦虑症。迄今为止，这些药物的临床试验结果好坏参半，这表明存在人群异质性问题，需要使用个性化的生物标志物驱动方法。另一条主要通路是 Hippo 信号通路，它与压力相关的精神疾病有关 [ 23 ]。
我们发现的大多数顶级血液生物标志物在焦虑症研究中的人类或动物模型大脑数据中都有先验证据，这表明它们与焦虑症的病理生理学相关（表 S2）。我们研究中的血液变化与文献中报道的大脑变化的共向性需要谨慎解读，因为它可能取决于大脑区域。
最热门的候选生物标记物也有证据表明其与其他精神疾病和相关疾病有关（表 S3），这为共病和某些疾病对焦虑的可能前兆效应提供了分子基础，反过来，焦虑在某些疾病中也起着前兆作用。具体来说，它们中的大多数与抑郁症（83%）以及酗酒（72%）、压力（56%）、精神分裂症（50%）和躁郁症（44%）有重叠，这与焦虑是大多数精神健康障碍中常见且经常得不到治疗和重视的因素相一致。
现象学
焦虑 SAS-4 由四个项目组成（补充图 S1）。它与该领域的标准量表 STAI State 具有很好的相关性，皮尔逊相关系数R = 0.67（补充图 S2A）。我们的聚类分析揭示了焦虑症状的结构（补充图 S3）。恐惧和不确定性关系最为密切。愤怒与量表上的其他项目距离较远，关联性较小。从本质上讲，焦虑反映并揭示了个人是否感觉到自己可能面临不利事件，并且对当前状态不满意。与此相关，我们表明 SAS-4 与生活满意度视觉模拟量表的项目呈负相关（总体满意度R = -0.58，幸福感R = -0.59，希望感R = -0.54，意义R = -0.59）（图 S2B）。
诊断
对于我们确定的生物标志物，将本研究中所有可用的证据组合成 CFE 评分，可突出那些对焦虑症有临床实用性的客观评估和风险预测的生物标志物（表 1）。这些生物标志物应在未来的临床研究和实际临床应用中单独测试，也应作为多基因生物标志物组进行测试。根据焦虑的初次临床表现，它们可能有助于区分患者是否真的严重焦虑并处于慢性风险中（图 3）。表型数据的整合，例如重复测量 SAS-4（可能通过手机应用程序以日常方式进行），可以进一步证实和阐明焦虑症的诊断，区分间歇性类型（如惊恐发作）和持续性类型（如广泛性焦虑症）。
图 3. 医生潜在报告的示例。
使用表1中的焦虑主要生物标志物面板 ( n = 19)。我们之前在一项自杀生物标志物研究中将该受试者 (Phchp328) 描述为具有高自杀风险，并在完成研究一年后自杀身亡。由于研究的匿名和隐私规则，我们当时没有向患者的临床医生提供任何信息。高焦虑组和低焦虑组 19 种生物标志物的原始表达值按性别和诊断进行 Z 分数计算。我们计算了高焦虑组 SAS-4 ≥ 60 和低焦虑组 SAS-4 ≤ 40 中生物标志物的平均表达值作为阈值。生物标志物增加时，第一个平均值应高于第二个平均值，生物标志物减少时则反之。因此，19 种生物标志物中有 15 种是一致的。我们还计算了第一年住院组和第一年未住院组的生物标志物平均表达值作为阈值。我们对所有未来住院和没有未来住院的情况都做了同样的事情。对于增加的生物标志物，第一个平均值应该高于第二个平均值，对于减少的生物标志物则相反。因此，19 个生物标志物中有 18 个在第一年和所有未来都是一致的。将每个表达增加的生物标志物的 Z 分数表达值与高焦虑组 SAS-4 ≥ 60 中的生物标志物的平均值以及低焦虑组 SAS-4 ≤ 40 的平均值进行比较，如果高于高焦虑，则得分为 1，如果低于低焦虑，则得分为 0，如果介于两者之间，则得分为 0.5。对于表达减少的生物标志物则相反。然后将数字化的生物标志物添加到多基因风险评分中，并根据面板中的生物标志物数量进行标准化，从而得到百分位数评分。我们对第一年住院和所有未来住院的情况做了同样的事情，从而得出慢性焦虑风险的综合评分。数字化的生物标记还用于与现有的精神科药物和替代疗法（营养品等）进行匹配。我们使用我们的大型数据集和文献数据库将生物标记与对基因表达产生与高度焦虑时相反影响的药物进行匹配。与生物标记匹配的每种药物都获得 1、0.5 或 0 的生物标记评分。将药物的评分相加，根据该患者中生物标记数为 1 或 0.5 的数量进行归一化，从而得到百分位匹配。
总体而言，我们对生物标志物的预测结果对女性比对男性更准确，AUC 值高出 10-20%。虽然其中有些可能是生物学因素，就免疫系统反应性和脑血相互作用而言，女性可能更高，但也有可能男性在自我报告焦虑症状方面不如女性准确（影响我们对状态预测的结果），并且寻求帮助的次数也不那么多（影响我们对未来住院预测的结果）。如果是这样，这种报告不足使得对男性使用客观的生物标志物测试变得更加必要。
关于如何将我们的生物标志物发现应用于临床实验室环境，我们建议使用顶级生物标志物组，例如 BioM-19（图 3）。实际上，每位接受测试的新患者都将根据已接受测试的类似患者的数据库进行标准化，并与他们进行比较以进行排名和风险预测，无论最终在临床上使用微阵列、RNA 测序或 PCR 等更有针对性的平台。随着数据库变得越来越大，可以而且应该建立规范的人口水平，就像任何其他实验室措施一样。此外，纵向监测个体内生物标志物的变化，测量最近的变化斜率、达到的最大水平以及过去达到的最大变化斜率，可能比简单地将个体内的水平与规范的人口水平进行横断面比较更有参考价值，正如我们在研究中所表明的那样。对于未来的护理方法，研究和开发应该侧重于顶级个体生物标志物，包括蛋白质水平。人们可能会寻找最佳的通用生物标志物（具有全部预测性）来获得可靠性，或者寻找最佳的个性化生物标志物（可通过性别甚至诊断进行预测），以获得更高的准确性。
治疗
生物标志物还可能有助于患者与药物匹配、测量治疗反应（药物基因组学）（图 3、表 3和S4），也可用于新药发现和再利用（表 3）。从药物基因组学分析来看，丙戊酸是最热门的药物。相对较新的随机对照临床试验数据支持使用丙戊酸治疗焦虑症 [ 24 ]。其他有趣的新型候选药物是 omega-3 脂肪酸和锂。从药物再利用分析来看，雌二醇是最热门的药物。最近的随机对照临床试验数据支持使用雌二醇治疗焦虑症 [ 25 ]。其他有趣的新型候选药物是洛哌丁胺和丙吡胺。如果使用得当，所有这些药物都是相对安全的，并且几十年来一直在临床实践中用于治疗其他适应症，这有助于将我们的研究结果直接转化为临床实践。
结论
总体而言，这项研究朝着更好地理解、诊断和治疗焦虑症迈出了重要一步。我们希望，在焦虑症全面爆发（或复发）之前，我们针对未来风险的特征生物标记物可用于预防方法。预防可以通过社会、心理或生物干预来实现（即早期有针对性地使用药物或营养保健品）。鉴于每 3 人中就有 1 人在一生中会经历一次临床焦虑症发作[ 26 ]，而且这种疾病在年轻人中的发病率似乎在上升[ 27 ]，焦虑症会严重影响生活质量，有时会导致酗酒等成瘾，甚至自杀，而且并非所有患者都能对目前的治疗产生反应，我们这样的努力的必要性和重要性怎么强调也不为过。
