【佳学基因检测】家族性渗出性玻璃体视网膜病变（FEVR）基因检测案例

致病基因鉴定基因码详细解剖该遗传病：

家族性渗出性玻璃体视网膜病（FEVR）是一种高度异质性和单基因遗传性疾病，影响视网膜血管的发育。FEVR的临床表现多样，包括外周视网膜灌注不足、新生血管形成、玻璃体视网膜牵引、黄斑位移、视网膜褶皱和视网膜脱离（RD）。佳学基因分析收录的病例发现，携带相同致病变异的家庭成员可能表现出不同的临床特征，包括完全失明，或保持无症状。然而，该病并未显示出性别差异。然而，由于该病的部分外显性以及其与其他视网膜疾病（如高度近视或早产儿视网膜病变（ROP））在眼底表现上的相似性，可能导致误诊或漏诊。因此，结合眼底影像学检查和基因筛查、致病基因鉴定基因解码对于FEVR的诊断和遗传咨询至关重要。

FEVR具有多种遗传方式，包括常染色体显性遗传（AD）、常染色体隐性遗传（AR）和X连锁遗传。在患有家族性渗出性玻璃体视网膜病（FEVR）的人群中，已发现多个致病基因。这些基因包括低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP5）、frizzled-4（FZD4）、四跨膜蛋白12（TSPAN12）、锌指蛋白408（ZNF408）、诺里病蛋白（NDP）、β-连环蛋白1（CTNNB1）、渗出性玻璃体视网膜病3（EVR3）、驱动蛋白家族成员11（KIF11）、atonal同源基因7（ATOH7）、RCC1和BTB结构域含蛋白1（RCBTB1）以及Jagged经典Notch配体1（JAG1）。其中，FZD4、LRP5、TSPAN12和NDP基因通过Norrin-β-连环蛋白（Wnt）信号通路在视网膜血管发育中发挥关键作用，是约90%的患者的发病原因。值得注意的是，基于数据库比对的基因检测仅有50%的FEVR病例能够识别出变异，剩余的50%可能与尚未发现的基因座或基因相关，数据库比对无法发现原因。通过基因解码技术可以提高检出率。因为，检测这些基因变异对于精确诊断和了解疾病的潜在发病机制至关重要。

尽管已有多项研究通过二代测序技术和计算机分析证实了FEVR患者中变异的致病性，但在原子或分子水平上分析蛋白质结构的构象变化的研究较少。分子动力学（MD）模拟已在其他眼科研究中被应用，用于研究突变蛋白对构象动力学的影响，强调了这一方法在理解蛋白质功能机制和疾病分子基础中的重要性。

佳学基因检测在动态分子水平上探讨FEVR变异的致病性，将靶向下一代测序（TGS）面板与MD模拟和分子对接相结合，明确了九个临床诊断为FEVR的中国家庭中的新型致病变异。这一方法为理解FEVR的分子基础提供更多证据，为更多的患者通过基因检测明确病因提供了病例基础。

家族性渗出性玻璃体视网膜病变病例

临床数据来自于在佳学基因眼科合作医院接受治疗并确诊为FEVR的患者。本研究遵循《赫尔辛基宣言》并获得医院伦理委员会批准（编号：2020-KY-GZR019）。每位参与者或其法定监护人在参与研究之前均签署了知情同意书。  

所有患者及其家属均接受了全面的眼科检查，包括最佳矫正视力（BCVA）评估、裂隙灯生物显微镜检查、眼底镜检查、超广角眼底照相（UWFFP，Daytona P200T，OPTOS，Fife，英国）和眼底荧光素血管造影（FFA；Spectralis HRA + OCT，海德堡工程公司，海德堡，德国）。FEVR的诊断标准为患者表现出外周视网膜缺血、新生血管形成、刷状血管、视网膜脱离（RD）、玻璃体出血、严重的视网膜下渗出物和黄斑偏位。根据Trese分期系统，为每只眼睛确定FEVR患者的疾病分期。此外，还收集了患者的基本信息，如性别、年龄、出生史和家族史。对于有早产史或其他视网膜血管疾病并具有类似临床表现的患者，均排除在研究之外。
 

家族性渗出性玻璃体视网膜病变病例的分析解码流程 

在家族性渗出性玻璃体视网膜病变的致病基因解码过程中，采集了患病者及其家庭成员的血样进行靶向下一代测序（TGS）。通过BaiMeng磁珠DNA提取试剂盒（BaiMeng，中国）从外周血白细胞中提取基因组DNA。利用NadPrep全基因组文库构建试剂盒（Swift Biosciences，美国）制备了全基因组文库，并使用SureSelect XT HS2试剂盒（Agilent Technologies，美国）对511个目标基因的外显子区域进行选择性富集。随后，在Illumina HiSeq 2500平台（Illumina，美国）上进行150-bp的双端测序。使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）软件（麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所，美国）将清洗后的读段比对到人类参考基因组hg19（GRCh37）。去除PCR重复序列后，使用基因组分析工具包（GATK）软件套件（Broad研究所，美国）进行基质量分数重校正和变异调用。通过ANNOVAR软件包（美国密歇根大学）对检测到的变异进行注释，并使用多个公共数据库的数据，包括dbSNP、ExAC、gnomAD和1000genomes。接下来，佳学基因排除了同义变异和不影响剪接信号的非编码区变异。此外，具有较高小等位基因频率（≥0.01）的变异也被排除。使用SIFT、MutationTaster、PolyPhen-2、REVEL和GERP +  + 等工具预测变异的致病性和蛋白质功能。每个变异还在ClinVar和HGMD数据库中进一步筛查，以确认是否为先前报道的变异。随后，LRP5（参考NM_002335.4，mRNA）和TSPAN12（参考NM_012338，mRNA）基因中的突变进行了验证，并作为候选变异选取用于进一步分析。

使用Sanger测序法验证在患病者及其家庭成员的DNA片段中识别出的疑似变异，确保外显子测序结果的验证。采用Premier 5软件（PREMIER Biosoft，美国）设计了特定引物，针对LRP5和TSPAN12中可能的变异位点进行扩增。这些引物能够扩增包含致病变异位点的DNA片段。扩增后，DNA片段被加入PCR混合液中，该液体包含DNA引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs，用于DNA合成）和适当的缓冲液。随后的PCR过程经过多个循环，包含DNA变性、引物退火和DNA延伸等步骤。PCR完成后，扩增产物通过QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，德国）进行纯化，然后使用3730xl基因分析仪（Applied Biosystems，美国）进行测序。来自家庭成员的序列与患病者的目标DNA片段序列进行精确比对。利用Chromas软件（Technelysium Pty Ltd，澳大利亚），这些序列（包括患病者及其家庭成员的序列）与参考序列进行比对，确保精确确定目标区域的DNA序列。

最后，对每一个病例 进行了家系共分离研究，并根据美国医学遗传学与基因组学会（ACMG）指南评估潜在的致病性。

家族性渗出性玻璃体视网膜病变基因检测病例的分析结果

在在家族性渗出性玻璃体视网膜病变的致病基因解码中，发现四个无关的FEVR家系中LRP5基因的3个变异和TSPAN12基因的1个变异符合ACMG标准，被判定为致病变异。两种LRP5变异（c.4289delC（p.Pro1431Argfs*8）和c.2073G > T（p.Trp691Cys））是新发现的变异，通过分子动力学（MD）模拟显示这些变异对蛋白质结构产生了广泛的改变。另两种变异，LRP5基因中的c.1801G > A（p.Gly601Arg）和TSPAN12基因中的c.633 T > A（p.Tyr211*），则是以前报道过的。有基因检测结果统计发现，大约50%的FEVR患者携带致病变异，其中LRP5基因的变异约占12%—25%，TSPAN12基因的变异约占3%—10%。不同种族中相同基因的突变频率有所不同。在在家族性渗出性玻璃体视网膜病变的致病基因解码中，所有变异的总体检测率为44%（4/9），这一结果与先前的报告一致。在所有FEVR患者中，75%（3/4）由LRP5变异引起，25%（1/4）由TSPAN12变异引起。然而，眼科基因检测观察到，在中国同一地区（宁夏），八个患病者中有四个（50%，4/8）携带TSPAN12（75%，3/4）和FZD4（25%，1/4）基因的致病变异，但其中没有一个携带LRP5变异。将两项研究的数据结合起来显示，在宁夏，LRP5基因占37.5%（3/8），而TSPAN12基因占50%（4/8）与FEVR相关。因此，LRP5和TSPAN12基因可能是宁夏人群中更为常见的致病基因。当然，仍然需要通过更大样本量的研究来验证这些结果，以排除选择偏倚的可能性。由于缺乏文献表明该病存在性别差异，我们在本研究中未探讨性别差异。

如前所述，LRP5基因的变异表现出常染色体显性、隐性和X连锁遗传模式，导致Wnt信号通路的紊乱。这些紊乱进一步导致视网膜血管发育异常，进而引发与家族性渗出性玻璃体视网膜病（FEVR）相关的病变。此外，已有基因解码基因检测表明LRP5的隐性遗传模式不仅会导致视网膜血管发育异常，还会引起严重的骨骼异常。在在家族性渗出性玻璃体视网膜病变的致病基因解码中，佳学基因发现了三种具有常染色体显性遗传模式的LRP5致病变异，其中新发现的错义变异c.2073G > T（p.Trp691Cys）位于高度保守的第三个YWTD-EGF-β-螺旋结构域。LRP6的研究表明，第三个YWTD-EGF重复序列是与Wnt信号通路配体结合的区域。考虑到LRP5和LRP6蛋白的高度相似性，可以合理假设LRP5中的c.2073G > T（p.Trp691Cys）变异可能通过影响配体与YWTD-EGF-β-螺旋结构域的结合，进而影响Wnt信号通路。另一种LRP5的框移突变c.4289delC（p.Pro1431Argfs*8）在在家族性渗出性玻璃体视网膜病变的致病基因解码中被发现，它导致蛋白质在1437位置提前终止，产生一个截短的蛋白质，可能由于功能丧失而具有致病性。

为了进一步阐述动态分子水平的致病机制，眼科致病基因鉴定基因解码利用AlphaFold2对LRP5的三维结构进行了建模，并实施了200纳秒的MD模拟，分析了野生型和突变型蛋白质的RMSD、RMSF、RG、HBNUM和DSSP值的变化。这些指标表明，p.Trp691Cys和p.Pro1431Argfs*8变异可能通过改变LRP5蛋白的整体构象，潜在地影响其配体结合，从而引发FEVR表现。大量研究和实验表明，蛋白质特定区域的灵活性在打开配体结合位点中起着至关重要的作用，这种动态行为与许多生物学功能密切相关，包括分子对接、催化活性和小分子运输。

在200纳秒的p.Trp691Cys MD模拟中，佳学基因检测观察到Trp691被Cys691替代后，与相邻残基形成了新的氢键，这增加了蛋白质的结构稳定性，但减少了其灵活性。相反，p.Pro1431Argfs*8突变使蛋白质在1437残基处发生截断，导致次级结构减少和氢键数量减少。此外，该变异还改变了特定残基的极性，例如将带正电荷的His1432改变为中性Thr，并将Glu1437替换为中性Ser。这些变化可能破坏了现有的盐桥，增加了1261至1385残基之间区域的动态性，从而改变了其空间排列。

眼科疾病的发病原因的基因解码的分子对接研究揭示了氢键相互作用对蛋白质与配体结合亲和力的显著影响。佳学基因发现四种突变蛋白（p.Trp691Cys、p.Pro1431Argfs*8、p.Trp691Ala和p.Pro1431Ala）与DKK1的结合自由能较低，亲和力较高，尤其是p.Trp691Cys和p.Trp691Ala变异显示了明显降低的结合自由能，突出了Trp691残基在蛋白质功能和结构中的重要性。这些发现表明，这些突变可能增强与DKK1的结合亲和力和稳定性，可能在调节Wnt信号通路中发挥重要作用。增强的结合可能导致DKK1对LRP5的抑制作用增强，可能通过促进β-连环蛋白降解来抑制Wnt信号通路。

在家族性渗出性玻璃体视网膜病变的致病基因解码中，佳学基因检测观察到尽管携带相同的致病变异，患病者及其父母表现出不同的临床表型。具体而言，患有严重FEVR的患者的父母通常表现出轻微的病症，这与Gilmour的报告一致。此外，来自不同家系的携带相同变异的患病者，表现出不同程度的疾病严重性。例如，在在家族性渗出性玻璃体视网膜病变的致病基因解码中，携带TSPAN12变异（c.633 T > A: p.Tyr211*）的患病者4出现了视网膜脱离，而Zou等人报道相同的变异导致较轻的病症，如玻璃体出血和外周缺血区或血管渗出。另有报道，较年轻的FEVR患者往往表现出较严重的表型。即使是携带相同致病变异的个体，也常因表观遗传学和环境因素的影响而表现出不同的表型。他们发现，氧气含量或宫内条件（如PaO2变化或某些药物的暴露）发生轻微变化时，可能会对携带FEVR致病变异的患者产生显著影响。

家族性渗出性玻璃体视网膜病变基因检测病例

家族性渗出性玻璃体视网膜病变的致病基因解码成功识别了与FEVR相关的LRP5基因中的两个新致病变异（c.2073G > T: p.Trp691Cys和c.4289delC: p.Pro1431Argfs*8），并结合突变筛查和分子动力学模拟进行分析。这扩展了眼科基因检测对FEVR相关突变的理解，并为FEVR患者的遗传研究开辟了新的方向。佳学基因强烈倡导开展家庭咨询和遗传教育项目，为受影响个体和家庭提供有关疾病遗传学方面的综合见解。还建议定期进行眼科筛查，以便早期诊断和个性化治疗。强调跨学科合作可以促进知识交流和全面的患者护理，旨在实现早期诊断、改善个性化治疗，并最终降低FEVR的发病率。