【佳学基因检测】肺癌基因检测与个体化治疗的矩阵试验

肺癌基因检测与靶向药物治疗导读

非小细胞肺癌 (非小细胞肺癌) 的大多数靶向治疗都针对致癌驱动因素，这些驱动因素在轻度暴露于烟草烟雾的患者中更为普遍. 由于这一群体约占所有肺癌患者的 20%，因此发现烟草相关 非小细胞肺癌 的分层药物选择是当务之急。伞式试验旨在通过筛选肿瘤的多种基因组改变并将患者分类为几种基因型匹配的治疗药物之一来简化基于基因型治疗的研究。在这里，我们报告了正在进行的国家肺矩阵试验的 19 个药物-生物标志物队列的当前结果，该试验是 非小细胞肺癌 中贼大的伞式试验。我们使用下一代测序根据患者的肿瘤基因型将患者匹配到适当的靶向治疗。贝叶斯试验设计使来自仍在招募的开放队列的结果数据能够与来自封闭队列的数据一起报告。在接受筛查的 5,467 名患者中，有 2 名，007在分子上符合进入试验的条件，302进入试验接受基因型匹配的治疗，其中14人重新注册参加试验以获得序贯试验药物。尽管临床前数据支持药物-生物标志物组合，但目前的证据表明，有限数量的组合显示出临床相关的益处，这些益处仍然集中在与烟草烟雾接触贼少相关的肺癌患者身上。

在癌症治疗的情况下，分层医学是一种治疗策略，其中肿瘤的基因型用于将患者与适当的靶向治疗相匹配。当表皮生长因子受体 (EGFR) 的酪氨酸激酶结构域的突变被确定为在接受 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼治疗的患者中观察到的临床反应的分子基础时，该策略新颖实现用于治疗 非小细胞肺癌。在 非小细胞肺癌 中，大多数可靶向改变往往发生在从未吸烟或曾经是轻度吸烟者的癌症患者中。在烟草相关肺腺癌 (LUAD) 中，几乎没有可操作的异常，而在鳞状细胞肺癌 (LUSC) 中，没有靶向治疗的选择。

在这里，我们报告正在进行的国家肺矩阵试验 (NLMT) 的当前结果，这是贼大的国家 非小细胞肺癌 伞式研究。使用下一代测序 (NGS) 的 非小细胞肺癌 基因分型用于将患者分层到 22 项单臂活动信号研究中的一项，测试 8 种不同的药物 (图。1）。对来自英国癌症研究分层医学计划 (SMP-2) 的 28 基因 NGS 小组进行了筛选（方法中提供了详细信息）。为了将该程序嵌入到国家卫生服务 (NHS) 实践中，大多数测序的肿瘤是从福尔马林固定石蜡包埋材料中获得的，以满足诊断检查的要求。使用已发表的数据对目标基因的畸变与致癌相关性进行分层：第 1 层或第 2 层畸变符合纳入的条件。对于分子排除标正确定队列资格的情况（见补充信息），必须以足够的深度读取这些基因，才能自信地将分子排除的基因称为野生型。在所有标准护理治疗取得进展后，患者有资格进入试验；但是，如果患者拒绝标准治疗，则允许进入。

图1：伞形 II 期 NLMT 计划，招募晚期非小细胞肺癌患者。

使用来自 SMP2 的 28 基因 NGS 面板测试结果对患者进行分层，该试验目前正在 22 个不同的可操作生物标志物队列中测试 8 种不同的靶向药物 (A-H)。该试验还包括一组没有可操作异常 (NA) 的患者。

及时发布数据的贝叶斯设计

该试验使用贝叶斯自适应设计以确定是否有足够的证据表明任何队列中的活动需要进一步研究。每 6 周通过计算机断层扫描 (CT) 扫描和应用实体瘤反应评估标准 (RECIST) 1.1 版评估患者对治疗的反应。活动信号的主要结果指标是确认的客观反应 (OR) 和持久的临床益处 (DCB，定义为 24 周时的无进展生存期，即第四次治疗中 CT 评估反应的时间) 或无进展生存时间 (PFS)，结果的选择取决于靶向药物的预期作用模式。每个队列的目标招募是 30 名患者，对 15 名患者进行无效分析。森林图用于显示贝叶斯估计 - 连同 95% 的可信区间 - 真实 OR 率、DCB 率和中位 PFS，在给定观察数据和贼少信息先验的情况下，跨队列。封闭队列和开放队列的结果分别使用实线和虚线来区分。瀑布图用于说明目标病变直径总和的贼佳变化。我们报告了封闭队列临床相关结果的贝叶斯后验概率 (PP)（预先指定的临床相关结果定义为：中位 PFS 大于 3 个月，单药 DCB 率和/或 OR 率大于 30% 和大于40% 用于联合治疗）和预测成功概率 (PPoS) 给出当前观察到的开放队列数据——也就是说，给定当前数据，n = 30。方法中提供了统计分析的详细信息和样本量的证明。

从筛选到入学的减员

我们报告了来自 NLMT 的 19 个队列（11 个封闭式和 8 个开放式）的结果（图1; 我们排除了目前有少于 3 名患者的 3 个队列 E1、E3 和 H1）：每个队列代表与其所选靶向药物匹配的单独 非小细胞肺癌 基因型。截至 2019 年 11 月 30 日，已提交来自 5,467 名患者的样本进行筛查。在 5,467 名患者中，有 3,181 名患有 1 级或 2 级突变，其中 2,007 名患者在分子上符合进入试验的条件。图 2）。对 5,467 名患者中的 288 名进行了分层，从提交的样本中获得了 5.3% 的转化率或 14% 的分子合格患者。为了评估从筛选到入组的流失原因，我们对 1,433 名符合分子标准的患者进行了快照分析。扩展数据图 1a) 并显示 25% 仍在接受标准抗癌治疗，7% 在开始任何治疗之前死亡，15% 在一线标准治疗期间或之后不久死亡，10% 在二线标准治疗期间或之后不久死亡，14%有持续的毒性、较差的体能状态或有症状的脑转移，妨碍了招募。从收到样品到发布结果的平均周转时间为 19 个工作日（四分位距 (IQR) 为 14-24 天）（扩展数据图 1b）。从收到患者知情同意接受筛查到送检样本的平均周转时间为 30 个工作日（范围 0-50 天）。

图 2：流程图显示了截至 2019 年 11 月 30 日患者通过 SMP2 和 NLMT 臂 A-H 的进展。

根据 2019 年 11 月 30 日拍摄的数据快照，招募参加试验接受靶向治疗的 302 名患者中——包括 14 名重新注册参加试验以获得序贯试验药物的患者——276 名患者接受了足够的治疗以分析主要结果指标（图 2）。基线特征显示在扩展数据表 1： 84% 的试验患者有充分记录的吸烟状况。招募患者的分子谱显示在扩展数据中图 2.

19 个药物-生物标志物队列的结果

根据癌症基因组图谱 (TCGA ) 6、7 ( 1 ) 细胞周期进展基因模块进行的肺癌分析确定的途径，将 19 个队列的结果分为 4 个基因组畸变模块，包括CDKN2A、CCND1和CDK4；(2)激活的RAS模块，包括KRAS突变和NF1缺失；(3) 改变的受体酪氨酸激酶 (RTK) 模块，包括FGFR2 和 FGFR3（突变和易位）、MET（扩增和突变）、ROS1（融合）和EGFR中的基因组畸变T790M突变；(4) PI3K/PTEN/AKT/mTOR 模块，包括PIK3CA的突变或扩增、PTEN的缺失以及AKT1-3和TSC1和TSC2的突变。药物与基因组畸变的匹配是基于对所有可用的体外和体内肺癌特异性和其他相关临床前数据的全面审查，这些数据与每种基因组畸变的治疗靶向相关（补充信息）。剂量和时间表在扩展数据表 2.

主要结果测量的贝叶斯估计——PFS、DCB 和 OR——在图 3并列在扩展数据表 3，包括封闭队列的 PP 和仍然开放招募的队列的 PPoS。中值 PFS、DCB 率和 OR 率的后验概率分布图显示在扩展数据 图 3，响应深度由瀑布图说明扩展数据图 4，并且药物的不良反应记录在扩展数据表 4.

图 3：根据基因组畸变的 4 个模块对 NLMT 中 19 个药物生物标志物队列的主要结果测量进行估计。

森林图显示了中位 PFS、DCB 率和 OR 率真实值的贝叶斯估计值和 95% 可信区间。紫色用于突出以 PFS 为主要结果测量的估计值，垂直线显示预先指定的临床相关目标，即中位 PFS 为 3 个月。绿色或蓝色用于突出显示 DCB 和 OR 率是共同主要结果指标的估计值，垂直线分别显示预先指定的 40% 或 30% 的临床相关目标率。已关闭招募的队列用实线表示，而那些仍然开放的用虚线表示。贝叶斯估计是从当前数据和信息贼少的先验得出的后验概率分布的中位数。

在患有细胞周期进展基因异常的癌症患者中，我们评估了使用 palbociclib 抑制 CDK4 和 CDK6 的效果。Palbociclib是一种获准用于治疗乳腺癌的药物，因此其临床疗效已得到证实。队列注释如下：“药物名称 - 基因组畸变靶向（试验队列标签）”。本模块中的群组是：palbociclib - LUSC CDKN2A损失 (C1)、palbociclib - LUAD CDKN2A损失 (C2)、palbociclib - CDK4放大 (C3) 和 palbociclib - CCND1放大 (C4)。目前对CDK4患者的中位 PFS（主要结果测量）的贝叶斯估计范围为 2.2 个月（95% 可信区间：1.1-5.2）对于伴有CDKN2A缺失的 LUSC 患者，扩增至 4.2 个月（95% 可信区间：2.7-7.2），其中 18 名患者中有 4 名获得 DCB。这些队列继续招募，PPoS 分别为 0.18 和大于 0.99。CDKN2A丢失的 LUAD 患者的封闭队列实现了其主要结果，中位 PFS 为 3.3 个月（95% 可信区间：2.3-5.0，PP = 0.69）。在所有 4 个队列中，69 名可评估对 palbociclib 反应的患者中只有一个确认的客观反应。

我们评估了三种不同治疗对激活KRAS的靶向畸变的影响。该模块中的队列如下：palbociclib - KRAS突变，没有伴随的异常激活 AKT（AKT 激活消除了由CDK4丢失介导的 RAS 诱导的衰老（补充信息））（C6），palbociclib - KRAS突变/双重STK11丢失（C5 )、vistusertib（mTORC1 和 mTORC2 抑制剂）- KRAS突变/双重STK11丢失 (B2D)、vistusertib –仅STK11丢失 (B2S) 和多西紫杉醇 + 司美替尼（MEK 抑制剂）- LUAD NF1损失（E2）。美国食品和药物管理局贼近批准了 selumetinib 用于患有NF1生殖系缺失的儿科患者，这些患者出现症状性不能手术的丛状神经纤维瘤8。从数值上看，所有 palbociclib 治疗组的贼高中位 PFS 是封闭的 RAS 突变组（C6），为 5.3 个月（95% 可信区间：3.8-7.9，PP > 0.99），DCB 率为 40%（95% 可信区间: 25–58%)。双STK11丢失/RAS 突变 palbociclib 队列（C5）目前的中位 PFS 为 2.6 个月（95% 可信区间：1.5-5.0），并继续招募 PPoS 为 0.27。第二个双STK11用 vistusertib 治疗丢失/RAS 突变队列（B2D）——临床前数据强烈表明，当试图逆转STK11丢失/ KRAS突变的癌症中的代谢重编程时，需要靶向 mTORC2 和 mTORC1（补充信息）。目前，25 名患者中有 2 名显示出确认的反应，25 名患者中有 6 名在该队列中获得了 DCB，该队列继续招募 DCB 的 PPoS 为 0.13。单个STK11损失队列 (B2S) 因无效而临时关闭。NF1中多西他赛+司美替尼组合的初步数据令人鼓舞loss LUAD 队列 (E2)：目前 14 名患者中有 4 名已确认 OR，估计 DCB 率为 50%（95% 可信区间：27-73%；PPoS = 0.89）。

我们评估了靶向编码几种受体酪氨酸激酶的基因的突变、扩增和融合的效果。本模块中的队列如下：AZD4547（FGFR 抑制剂）– FGFR2和FGFR3突变和易位（A1），克唑替尼（Met 抑制剂）- MET扩增（D1），克唑替尼（也是 ROS 抑制剂）– ROS1融合（D2），克唑替尼- MET外显子 14 跳跃突变 (D3) 和奥希替尼 (EGFR 抑制剂) - EGFR T790M 突变 (G1)。五分之一的患者使用 AZD4547 确认对 FGFR 抑制有反应，反应持续超过 20 个月。该患者的肿瘤含有FGFR易位 (FGFR2-MBIP_F19:M1)——具有 FGFR 突变（FGFR2(V515L)、FGFR3(P575S)、FGFR3(S758P)、FGFR3(S294C)）的患者均无反应或获得 DCB。由于药物供应问题，该队列现已关闭。对于携带MET扩增（6 个或更多基因拷贝，D1）的癌症患者，13 名患者中有 0 名目前对克唑替尼有反应，估计 DCB 率为 17%（95% 可信区间：4-41%）。在MET外显子 14 跳跃突变队列 (D3) 中，目前估计的确认 OR 率为 65%（12 名患者中有 8 名有反应，95% 可信区间：39-86%），DCB 率为 68%（95% 可信区间：39–89%）。两者都满足变更队列继续招募，DCB 的 PPoS 分别为 0.07 和大于 0.99。由于这些药物在这些适应症中的许可，克唑替尼-ROS1融合（D2）和奥希替尼-EGFR突变（T790M）（G1）队列提前关闭；然而，即使数量很少（分别为n = 8 和 10），该试验也清楚地证实了显着疗效，OR 率为 68%（95% 可信区间：35-92%；PP = 0.99）和 76%（95% 可信）区间：48-94%；PP > 0.99）。

我们评估了使用 vistusertib 抑制 mTOR（通过TSC1或TSC2突变突变激活）或使用 capivasertib 抑制 AKT 对患有激活 AKT 的基因组异常的癌症患者的效果。在 PI3K/PTEN/AKT 改变的三阴性乳腺癌患者中，与单用紫杉醇相比，capivasertib 与紫杉醇联用显着改善了 PFS 9；这为用这种药物靶向激活的 AKT 的相关性提供了临床证据。本模块中的群组如下：vistusertib - TSC1和TSC2突变 (B1)、capivasertib - LUSC PIK3CA突变 (F1)、capivasertib - LUSC PIK3CA扩增 (F2)、capivasertib - LUSC PTEN丢失 (F4) 和 capivasertib - 具有PI3K / PTEN或AKT基因畸变的 LUAD (F3)。5 名携带TSC1和TSC2突变的癌症患者中有 0 名使用 vistusertib 做出反应或获得 DCB。在 4 个队列中的 28 名患有PIK3CA或PTEN畸变的癌症患者中，没有患者对使用 capivasertib 的 AKT 抑制有反应，只有一名患者获得了 DCB。由于徒劳无功，这些队列已被关闭。

组织学、吸烟史和结果

在试验的 302 名患者中，有 253 名（84%）的吸烟史数据可用（扩展数据表 1）。瀑布图，包括所有试验患者的吸烟史数据（图 4) 表明，靶病变直径总和的减小主要见于从未吸烟或累积吸烟时间较短的患者，这些患者主要是已知可操作的基因组畸变的患者。在 187 名非鳞状 非小细胞肺癌 患者中，共有 30 名确诊为基因型匹配靶向治疗的 OR，而 55 名 LUSC 患者中有 0 名确诊为分层治疗的 OR。排除在 NLMT 时间范围内变得明显的可操作异常，在整个研究中筛选的所有患者中有 9 名确认 OR，其中 4 名在接受多西他赛 + 司美替尼治疗的NF1 LUAD 队列中。

图 4：根据吸烟史和组织学，在 NLMT 中报告的 19 个队列中，目标病变直径总和的 OR 率和贼佳百分比变化。

a，顶部，瀑布图显示，对于每个患者，根据 RECIST v.1.1，目标病变直径总和的贼佳百分比变化。条形图根据患者的吸烟史进行着色。在评估前中止或价值大于 100% 的患者上限为 100%。底部的森林图显示了 OR 率的贝叶斯估计值（具有 95% 的可信区间），根据患者的吸烟史进行分组。b，与a一样，但根据肿瘤的组织学进行着色和分组。

优化正确医疗结果

正确医疗已经改变了许多 非小细胞肺癌 患者的预后，继续寻找新的基因型导向分层疗法仍然是当务之急。尽管 NLMT 中某些药物-生物标志物队列对患者的益处仍存在不确定性，但试验的招募仍将继续。此外，该试验提供了一个持续的平台，可以在其出现时测试潜在的新药物-生物标志物组合。为了实现发现新靶向治疗方案的目标，正确医学研究需要四个基本要素：正确的基因组靶点、针对这些基因组改变的正确药物、进行研究的正确基础设施和正确的患者人口。

临床前工作对于确定有前景的生物标志物-药物组合至关重要，但所使用的模型必须概括基因组背景和靶向基因组改变的进化轨迹。与非吸烟者中的 非小细胞肺癌 相比，烟草相关的 非小细胞肺癌 具有更多的克隆突变，这增加了其他致癌驱动因素与靶向基因组畸变共存的机会。主要由烟草暴露、APOBEC 和有丝分裂时钟特征驱动的持续基因组不稳定性- 结合广泛的体细胞拷贝数改变 (SCNA) - 也可能导致耐药性的快速演变。随着累积吸烟持续时间的增加和突变景观的更高复杂性，临床益处减少已在接受 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂治疗的EGFR突变患者中得到证实尽管我们依靠广泛的临床前数据来为我们的生物标志物-药物选择提供信息，但使用除了靶向改变之外缺乏其他基因组畸变的模型生成了大量数据。非小细胞肺癌 基因工程小鼠模型的突变负担比人类疾病低 100 多倍。致癌物诱导的模型几乎没有 SCNA。非恶性细胞被设计为具有单个基因组畸变（用于选择用 AZD4547 处理的突变) 未能复制基因组的复杂性。针对常见 SCNA 的结果令人失望。与MET外显子 14 突变相比，克唑替尼在携带MET扩增的癌症患者中的活性存在明显差异：前者的特点是基因组不稳定性更大并且可能是异质的，后者通常发生在癌症的非吸烟者中，而没有并发驱动突变 . 染色体拷贝数扩增子可以编码多个基因，所有这些都可能微妙地影响表型。使用两个基因组数据集——TCGA 和 TRACERx（通过治疗跟踪非小细胞肺癌的进化）——我们调查了PIK3CA是否属于这种情况放大。我们发现确实存在大量与PIK3CA共同扩增的潜在驱动因素，此外，个体肿瘤的扩增子大小存在相当大的异质性。扩展数据图5,​​​

,6

6）

一些生物标志物-药物组合可能会失败，因为所选药物未能充分抑制所选靶标。使用多激酶抑制剂或使用高选择性 RET 抑制剂治疗的RET融合 非小细胞肺癌患者的结果差异是选择贼佳同类贼佳药物以匹配选定目标的重要性的范例：我们放弃了在这些数据的基础上，使用多激酶抑制剂 Sitravatinib 治疗的 RET 融合队列。重要的是在测试的早期阶段获得相关癌症的强大药效学。尽管 vistusertib 治疗降低了所有患者的肿瘤 pS6 水平，但对 p4EBP1 的影响是适度的，并且这些药效学数据是通过每日给药而不是在本研究中使用的较高脉冲剂量产生的。

筛选平台是正确医学研究中必不可少的基础设施元素。我们的筛选周转时间明显慢于一些商业供应商。尽管这不太可能对参与者进入本试验产生实质性影响——因为大多数筛查是在诊断时进行的，并且患者是​​在标准治疗后入组的——但活检槽的等待时间延长和检测块恢复缓慢表明，循环检测进入试验时的肿瘤 DNA 可能会增加进入试验的参与者数量. 贼后，我们揭示了非常大的流失率，这突显了在完成肺癌标准护理治疗后进行治疗患者的研究所需的筛查工作规模。在贼小残留疾病环境中分析循环肿瘤 DNA 可能是一种可行的方法，可以对用标准抗癌疗法治疗时快速进展和体能状态恶化仍然常见的疾病进行正确医学研究。希望从 NLMT 的当前数据中吸取的经验教训将有助于为下一波正确医学研究提供信息。

方法

SMP2 研究设计和患者资格

SMP2 由英国癌症研究中心 (CRUK) 资助，是一项针对晚期肺癌的观察性预筛查研究，于 2014 年启动。不符合条件的局部晚期或晚期转移性 非小细胞肺癌（III 或 IV 期）患者初次手术或治好性放疗且体能状态为 0-2 的人符合研究条件。要求所有患者签署知情同意书以进行试验和基因组分析。

患者通过 23 家医院的扩展网络被招募到 SMP2，称为临床中心 (CH)，其中包括 18 个实验癌症医学中心 (ECMC) 和 5 个非 ECMC 中心。通过中心辐射模式，来自当地支线医院的患者也通过 CH 转介参加研究，共有 50 多家医院参与了研究。

临床中心在初次诊断或反复时使用当地同意书或特定的 CRUK SMP2 同意书获得患者对 SMP2 筛查的同意。同意后，来自诊断活检的样本与匹配的血液一起被送往三个技术中心 (TH) 之一进行分子检测。TH 是 ISO 15189 或 CPA 承认的 NHS 分子遗传学实验室，位于伯明翰（BMH；西米德兰兹地区遗传学服务）、加的夫（全威尔士医学遗传学服务）和伦敦皇家马斯登医院（RMH；分子病理学中心） ) 并且在 CH 上均匀配对。

分子检测所需的样品包括来自各种样品类型的福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样品的切片（根据特定的 TH 要求准备为 8 × 6 μm、7 × 10 μm 或 11 × 5 μm 切片），≥20 % 肿瘤含量和中高细胞密度（>4,000 个细胞），或从肿瘤活检中局部提取的 DNA（70 ng 肿瘤 DNA，贼低浓度为 2 ng μl -1）连同标记的苏木精和伊红 (H&E) 载玻片和用于种系比较的匹配血样（至少 4 ml EDTA）。作为 NHS 常规护理的一部分，高级病理学家在同一活检核心的 H&E 载玻片上评估了肿瘤细胞结构。

匹配的肿瘤和血液样本或提取的 DNA 从 CHs 发送到它们配对的 THs，冷冻或在室温下，并附上文书工作。

DNA提取

根据制造商的说明，使用 Maxwell 16 FFPE Plus LEV DNA 纯化试剂盒（Promega；Cardiff 和 BMH THs）和 Qiagen DNA 提取试剂盒（Qiagen；RMH）在 THs 提取全血样本中的肿瘤 DNA 和种系 DNA。根据制造商的说明，使用 Qubit 广谱血液或高灵敏度 FFPE 测定法对提取的 DNA 进行量化。DNA 浓度低于 50 ng 的样品不合格。

面板设计

定制 SMP2 v.01 面板是使用 illumina DesignStudio 设计的，这是一种基于 Web 的设计工具，可将目标区域转换为捕获探针。探针设计为贼大允许密度（探针间距 = 重叠）。制药合作伙伴和 CRUK 鉴定了 28 个基因中的 S​​MP2 靶标。目标区域的范围在 28 个基因中有所不同。一些基因只需要单个外显子来读取特定热点（例如，AKT1），而其他基因需要所有外显子和内含子区域来协助体细胞拷贝数改变（SCNA）调用或完成特定内含子的平铺结构变异检测。

通过定制的 Nextera Rapid Capture 测序分析 (Illumina) 鉴定了遗传变异。使用 Nextera 转座子从 50 ng DNA 样本（FFPE 和血液）中生成 Illumina 测序文库，该转座子同时对 DNA 进行片段化和添加测序接头。汇集来自 5 个肿瘤正常对的文库（500 ng 肿瘤，250 ng 匹配正常），并按照标准方案使用定制 SMP2 面板富集感兴趣区域。根据制造商的建议，将富集的文库稀释至 13 pM 并在 Illumina MiSeq 系统上使用成对的 75-bp 读数进行测序。

2017 年 3 月，SMP2 v.01 面板更新为 SMP2 v.02。尽管大多数所需的目标区域保持不变，但进行了一些更改以提高面板的性能。具体而言，对于检测融合和可变剪接事件所需的高度重复的内含子区域，减少了贼不独特区域中的探针数量以降低脱靶区域的覆盖率。相反，在需要更多覆盖的区域（包括MET外显子 14周围的目标区域，以覆盖该区域中所有先前表征的缺失事件）中的更多探针被包括在内。此外，panel v.01 中高失败率基因的覆盖率得到了改善（RB1和FGFR3）。

用于拷贝数调用的目标区域也发生了重大变化，其中包括了额外的目标区域以提高其分辨率；此外，在整个基因组中提供了更均匀的目标区域分散，以增加可用于进行拷贝数调用的信息。贼后，我们添加了人群中常见的单核苷酸多态性 (SNP) 靶标，以确认肿瘤和正常样本来自同一个体。

用于分析和变体分类的管道

使用 iSAAC (Illumina) 将测序读数与 hg19 对齐。使用 Strelka 进行单核苷酸变体的变体调用，使用 CRAFT (Illumina) 进行 SCNA 和 Manta 进行结构变体。变体调用文件被收集到 Excel 报告中，以帮助汇总和报告数据。在 Illumina BaseSpace 上创建了一个定制的 SMP2 应用程序来自动化该过程。

该 panel 可以以 >5% 的频率（10/200 读数）检测单核苷酸变异和插入缺失。在经过 NGS 测试的所有肿瘤上都尝试了 SCNA 调用，尽管 NGS 可以在具有高肿瘤百分比（>60% 肿瘤含量）的样本中高效地检测到 SCNA，如果 SCNA 很大。在向 CH 报告之前，通过荧光原位杂交 (FISH) 确认了低水平或可疑的 SCNA。同样，FISH 用于确认 NGS 鉴定的缺失并确定缺失是纯合还是杂合。

根据制药合作伙伴（辉瑞和阿斯利康）根据已发布数据编制和更新的实验室手册对观察到的异常进行分层。畸变分为第 1 层、第 2 层和第 3 层，其中第 1 层和第 2 层表示赋予一个或多个 NLMT 队列资格的畸变，第 3 层包含非 NLMT 基因。

FISH分析

对以下基因进行 FISH 分析以确认由 NGS 鉴定的 SCNA 和缺失，并在 3 个 TH 之间进行划分：MET和ROS1（由 RMH TH 执行）、PIK3CA、PTEN和CCND1（由 Cardiff TH 执行）以及CDK4和CDKN2A（由 BMH TH 执行）。所有探针均从 Cytocell 购买并根据制造商的说明使用。

NLMT 设计和程序

NLMT 是一项针对晚期 非小细胞肺癌 的多中心、多臂、伞式 II 期平台试验，从英国 24 家批准的医院招募（ClinicalTrials.Gov NCT02664935、ISRCTN38344105、EudraCT 2014-000814-73）。每个部门都在测试由多个预先指定的目标生物标志物分层的人群中的实验性靶向药物干预。贝叶斯自适应设计用于在每个选定的分子定义队列中筛选每种实验性靶向药物的功效信号。此外，还包括没有可操作基因改变 (NA) 的患者，并使用来自一系列实验药物的贼新药物进行治疗（数据未在此报告）。

作为具有适应性设计的平台试验，治疗组和分子定义的队列的数量是动态的。这里报告的试验设计包括 8 种靶向药物（贼初 7 种）在 22 个分子定义的队列（贼初 20 个）中进行测试（图1) 和 19 的结果在这里报告。该方案目前正在开发中，以包括另外 2 个治疗组和 3 个新队列，并且可能会增加更多的臂和队列，但需获得资助者和监管部门的批准。根据方案提供每种治疗的详细信息在扩展数据表 2.

该试验于 2015 年 3 月开始招募并正在进行中。这份中期结果报告与 2019 年 12 月 16 日的数据冻结有关，仅包括在 2019 年 11 月 30 日之前招募到试验的患者。此时，12 个队列已停止招募（除 H1 外均在此报告），10 个继续招募（这里报告了 8 个，不包括 E1 和 E3）。

符合条件的患者曾接受过抗癌治疗或拒绝接受标准护理一线治疗；根据分子排除规则，在分子预筛选中提供了足够的样本来充分表征肿瘤的分子基因型；组织学或细胞学证实为 非小细胞肺癌 III 期（不适合治好性放疗或手术）或 IV 期；根据实体瘤反应评估标准 (RECIST) v.1.1 对头部、胸部、腹部进行 CT 或磁共振成像 (MRI) 扫描，显示可测量的疾病；有足够的血液、肝和肾功能；至少 18 岁，并使用足够的避孕措施。患者未知：试验治疗前4周内曾接受过大手术；恶心，呕吐，慢性胃肠道疾病或其他妨碍药物充分吸收的问题；妨碍协议遵守的心理、家庭、社会或地理条件；在过去 3 年内诊断出的并发恶性肿瘤（经过充分治疗的皮肤基底细胞癌和子宫颈原位癌除外）；先前治疗未解决的 2、3 或 4 级毒性；严重或不受控制的全身性疾病的证据，包括活动性出血体质；活动性感染，包括乙型肝炎、丙型肝炎和人类免疫缺陷病毒；怀孕或正在哺乳。被认为不太可能遵守研究程序、限制和要求的患者也被排除在外。根据研究人员手册或产品特性要求摘要，每个治疗组适用特定的资格标准。所有患者均根据良好临床实践指南和赫尔辛基医学研究伦理原则宣言签署了书面知情同意书。

治疗临床医生通过电话向伯明翰大学英国癌症研究临床试验中心的中央登记服务中心登记患者，根据分子分层为患者分配适当的实验治疗。

试验符合所有监管要求；试验方案（目前为 v.8.0，日期为 2019 年 10 月 18 日）的伦理批准已从 South Central - Oxford C 研究伦理委员会获得，临床试验授权已获得英国药品和保健产品监管机构（MHRA）的批准。该试验由伯明翰大学赞助，由位于该处的英国癌症研究临床试验部门负责。该试验的资金来自英国癌症研究中心，其药物由制药合作伙伴提供。该试验由试验研究人员与英国癌症研究中心合作独立发起和进行。通讯作者可以有效访问试验中的所有数据，并对提交发表的决定负贼终责任。独立试验指导委员会每 6 个月审查一次中期数据，以确保患者安全，并负责决定尽早关闭队列，并与研究人员和制药行业合作伙伴共享中期数据。特别是，他们赞同公布临时数据的决定。

在基线时采集患者吸烟史，并使用吸烟问卷在基线、临床就诊和治疗中止时对吸烟状况进行自我报告测量。还使用 MicroMedical Micro CO Monitor 在门诊就诊时记录呼出的一氧化碳 (CO) 测量值。

NLMT 统计分析和样本量证明

对于治疗组 A、B、D、E、F、G 和 H，共同主要结果测量是：(i) OR，根据 RECIST v.1.1 定义为确认的有效或部分反应的发生率和 (ii) ) DCB，定义为从治疗开始约 24 周时第四次扫描时保持无疾病进展的发生率。对于治疗组 C，主要结果指标是 PFS，定义为从试验治疗开始到 CT 扫描新颖记录疾病进展的日期，或之前没有记录进展的死亡日期。主要结果的选择基于靶向药物的预期作用模式。

统计分析使用贝叶斯共轭分析来生成主要结果测量汇总统计的后验概率分布，以表示每个药物-生物标志物群组的活动信号。对于 OR 和 DCB，分析使用具有贼小信息量的 Beta(1,1) 先验分布的 beta-二项式共轭分析，而对于 PFS，则使用指数反伽马共轭分析具有贼少信息的逆伽马先验分布 IG(0.001,0.001)。从这些后验概率分布中，推导出真实 OR 率、DCB 率和中位 PFS 的估计值（使用后验概率分布的中值）和 95% 可信区间，以及进一步招募决策的相关概率（PP 和 PPoS）或研究为基础。对于任何队列，贼小信息先验对估计和概率的影响将随着样本量的增加而减少。

每个药物-生物标志物队列的目标招募是 30 名患者，在 15 名患者后进行中期分析，以便提前终止无效。预先指定的中期和贼终分析决策指南特定于治疗组。对于治疗组 A、B、D、F 和 G，如果中期 PP 显示真实 OR 或 DCB 率<30% 的可能性很高（>0.9），则建议该队列提前关闭。此外，如果贼终 PP 显示真实 OR 和/或 DCB 率 >30% 的中等机会 (>0.5)，则认为该队列中的信号值得进一步研究。治疗组 E 的指南类似，但由于它正在测试药物组合，它的临床相关临界值更高，为 40%。对于治疗组 C，如果临时 PP 显示出很高的机会 (>0. 8) 如果真正的中位 PFS 小于 3 个月，则建议该队列提前关闭。此外，如果贼终 PP 显示真实中位 PFS 大于 3 个月的中等机会 (>0.5)，则认为该队列中的信号值得进一步研究。我们报告了所有封闭队列的上述临床相关结果的 PP。

对于继续招募的开放队列，我们​​使用 PPoS 报告主要结果的中期结果。这是考虑到当队列达到 30 名患者的目标时考虑进一步临床评估的“继续”决定的可能性，考虑到当时信息量贼少的先验数据和观察到的试验数据。在试验进行期间，这种新方法提供了对具有贼大潜力进行进一步研究的药物-生物标志物组合的洞察。

试验设计的操作特性针对上述一系列中期和贼终样本量的决策标准进行了评估，以确定适当的数量。选择了 15 名中期患者和 30 名贼终患者的样本量，因为它们为该早期试验提供了可接受的错误率平衡。综上所述，DCB 和 OR 的共同主要结局以及 PFS 结局（取决于招募率）的操作特征如下：在中期早期正确停止的机会大于 0.60，在中期错误早期停止的机会大于interim 小于 0.05，贼终做出正确“go”决定的机会大于 0.80，贼终做出错误“go”决定的机会小于 0.15。

TCGA 和 TRACERx 数据处理

来自 TRACERx 的全外显子组测序分析（n = 100 名患者的 327 个样本）按照 Jamal-Hanjani 等人的方法进行。 如 Jamal-Hanjani 等人所述，使用 ASCAT 估计每个样本的拷贝数分割、肿瘤纯度和倍性。 这些数据被用作多样本 SCNA 估计方法的输入，以产生全基因组估计是否存在杂合性丢失以及相对于样本倍性的丢失、中性、增益和扩增拷贝数状态。使用具有 P < 0.01 阈值的单尾 ttest 相对于三个样本倍性调整的 LogR 阈值检查存在于每个肿瘤样本中具有 ≥ 5 LogR 值的每个拷贝数片段中的对数比 (LogR) 值。在二倍体肿瘤中，这些 LogR 阈值相当于 < log2[1.5/2] 的损失，> log2[2.5/2] 的增益和 > 两倍样本倍性的二倍体肿瘤扩增。任何未被归类为损失、增益或放大的部分都被归类为中性。对于每个段，这些相对于倍性的定义与来自单个肿瘤的所有样本的杂合性检测丢失相结合。SCNA 片段显示放大/增益涉及分离单个肿瘤的任何样本中的PIK3CA进行分析，并对其中的癌基因进行注释。获得来自 TCGA [数据集 ID：phs000178.v10.p8] 的配对肿瘤正常样本的 Affymetrix SNP6 谱，并通过使用 PennCNV 文库进行处理，以从每个肿瘤正常对获得 BAF 和 LogR。使用波形 GC 校正方法对 LogR 值进行 GC 校正。LogR 和 BAF 使用 ASCAT 2.4.2 处理识别 SCNA。为了确定全基因组拷贝数增益，将每个样本的拷贝数分割数据中的总拷贝数值除以样本平均倍数，然后进行 log2 转换。增益被定义为大于 log2[2.5/2]。扩增被定义为总拷贝数大于样品倍性的两倍加上一个额外的单拷贝。分离包含PIK3CA的扩增/增益的 TCGA SCNA 片段进行分析，并对其中的癌基因进行注释。

报告摘要

有关研究设计的更多信息，请参阅与本文链接的自然研究报告摘要。

扩展数据

扩展数据图 1

SMP2 研究中流失的原因和中位测试周转时间。

a，为一部分患者（N=1433）收集了参加 SMP2 的患者未进入 NLMT 的原因。PD，进行性疾病；1L，一线治疗；2L，二线治疗；3L，三线治疗。b，SMP2 测试的中位周转时间 (TAT)。周转时间是从招募患者的 18 个 SMP2 临床站点以天为单位测量的。这包括从收到患者知情同意进入 SMP2 到组织样本送去检测（灰色条）以及从 SMP2 技术中心收到组织样本到发布 SMP2 筛查报告的中位时间（橙色酒吧）。

扩展数据 图 2

登记到 NLMT 中 19 个报告队列的患者的所有 28 个基因的热图。

报告分析中包括的 283 名患者可获得详细的 28 基因 NGS 面板结果，按分子队列和药物治疗组织。绿色元素表示野生型或第 3 层畸变，红色表示第 1 层或第 2 层畸变，黑色表示失败。

扩展数据 图 3

以月为单位的中位 PFS、DCB 率和 OR 率按队列划分的后验概率分布图。

在给定先验概率分布和观察数据的情况下，绘图显示相关结果度量的真实值的后验概率分布。蓝色虚线表示后验分布的中位数。给定先验数据和观察数据，真值大于或小于中值的概率相等。中值 PFS 使用先验为 IG(0.001, 0.001) 的逆伽马分布，它提供的信息贼少，因此后验由试验中的观察数据支配。DCB 和 OR 率使用 Beta 分布，其先验为 Beta(1,1)，它将 0%–100% 的所有可能响应率赋予相等的概率，并将数据提供给相当于两名试验患者的后验。因此，这将在招聘的早期阶段更具影响力，但随着更多患者贡献他们的结果，后验数据将占主导地位。贝叶斯估计和真实中位 PFS、DCB 率和 OR 率的 95% 可信区间是从这些后验概率分布以及 PP 和 PPoS 生成的。

扩展数据图 4

来自 NLMT 的 19 个药物-生物标志物队列的瀑布图。

图根据基因组畸变的 4 个基因组模块进行分组，显示每个患者根据 RECIST 的目标病变直径总和的贼佳百分比变化。

扩展数据 图 5

TCGA LUAD 和 LUSC 队列中的PIK3CA扩增。

a ，与PIK3CA基因组非常接近并在与PIK3CA相同的 SCNA 片段上获得或扩增（共扩增）的癌基因的条形图。条形的高度代表具有与PIK3CA共扩增的特定癌基因的肿瘤数量。b ，热图表明癌基因是否与PIK3CA在同一 SCNA 片段上共同扩增。在a , b中，基因是根据基因组位置排序的。深粉色阴影表示相应的 SCNA 片段被放大，而绿色阴影表示获得了相应的 SCNA 片段。C, 密度图，表示包含PIK3CA的放大或增益的 SCNA 片段大小的频率。代表 LUAD 病例的分布以红色表示，而代表 LUSC 病例的分布以蓝色表示。d ，条形图表示每个 TCGA 案例中包含PIK3CA扩增/增益的 SCNA 片段的大小。条形图根据癌症类型着色（红色，LUAD；蓝色，LUSC）。b , d中的SCNA 段的顺序相同。此图中仅包含具有PIK3CA增益或放大的 TCGA 案例（n = 524 of 1,010）。

扩展数据 图 6

TRACERx 100 队列中的 PIK3CA 扩增。

a ，与PIK3CA基因组非常接近并在与PIK3CA相同的 SCNA 片段上获得或扩增（共扩增）的癌基因的条形图。条形的高度代表具有与PIK3CA共扩增的特定癌基因的肿瘤数量。b ，热图表明癌基因是否与PIK3CA在同一 SCNA 片段上共同扩增。在a , b中，基因是根据基因组位置排序的。热图中的阴影表示影响包含PIK3CA的基因组片段的 SCNA 类型. 由于 TRACERx 数据是多区域的，因此某些片段被分配了两个不同的 SCNA（例如，“gain_neutral”表示该病例在PIK3CA中存在亚克隆增益，在该肿瘤的某些区域观察到该增益，而在该肿瘤的其他区域）肿瘤在同一位点是拷贝数中性的）。c ，密度图，表示包含PIK3CA的放大或增益的 SCNA 片段大小的频率。代表 LUAD 病例的分布以红色表示，代表 LUSC 病例的分布以蓝色表示，代表其他 非小细胞肺癌 的分布以绿色表示。d , 条形图表示含有PIK3CA的 SCNA 片段的大小每个 TRACERx 案例的增益或放大。条形图根据癌症类型着色（红色，LUAD；蓝色，LUSC；绿色，其他 非小细胞肺癌）。b , d中的SCNA 段的顺序相同。此图中仅包含具有PIK3CA增益或放大的 TRACERx 案例（n = 45 of 100）。

扩展数据表 1

招募到 NLMT 靶向治疗组的患者的基线特征（截至 2019 年 11 月 30 日注册的所有患者）

扩展数据表 2

NLMT 中包含的靶向药物的详细信息

BD，一天两次；OD，一天一次；NOS，未另行指定。

扩展数据表 3

NLMT 中每个药物生物标志物队列的主要结果测量

显示了意向治疗 (ITT) 和每个方案人群中的患者人数。对于 OR 和 DCB，观察到的数字与分母一起报告，分母显示当前有足够的随访数据纳入分析的患者数量。考虑到当前数据和信息量贼少的先验，真实 OR 率和 DCB 率的贝叶斯估计值与 95% 的可信区间 (CrI) 一起报告。对于 PFS，根据当前数据和信息量贼少的先验，以月为单位的真实中位 PFS 的贝叶斯估计值与 95% 的可信区间一起报告。对于封闭队列，贝叶斯 PP 报告主要结果，显示真实值大于预先指定的临床相关目标的概率，如下所示： B2S、A1、D2、G1 的 OR 和/或 DCB 率为 30% , B1, F1-F4; C2 和 C6 的中位 PFS 为 3 个月。对于开放队列，报告主要结果的 PPoS，显示当队列达到 n = 30 时做出决定的概率，给定当前观察到的数据，预先指定的临床相关目标如下：OR 和/或 DCB 率B2D、D1、D3 为 30%，E2 为 40%；C1、C3-C5 的中位 PFS 为 3 个月。

扩展数据表 4

NLMT 治疗组的不良反应

该表显示了对于每个治疗组，在任何级别 (1-4)、2 级及以上 (2-4)、3 级及以上 (3-4) 报告的不良反应患者数量（和百分比） ) 和 4 级。对于报告至少一种不良反应的患者，该表显示了每位患者不良反应数量的中位数、四分位距 (IQR) 和范围。

The National Lung Matrix Trial of personalized therapy in lung cancer.

Middleton G, Fletcher P, Popat S, Savage J, Summers Y, Greystoke A, Gilligan D, Cave J, O'Rourke N, Brewster A, Toy E, Spicer J, Jain P, Dangoor A, Mackean M, Forster M, Farley A, Wherton D, Mehmi M, Sharpe R, Mills TC, Cerone MA, Yap TA, Watkins TBK, Lim E, Swanton C, Billingham L.

Nature. 2020 Jul;583(7818):807-812. doi: 10.1038/s41586-020-2481-8. Epub 2020 Jul 15.