【佳学基因检测】结直肠癌基因检测及其他筛选方法

为什么要推广结直肠癌的早期基因检测筛查？

结直肠癌(CRC)是全球贼常见和发病率贼高的癌症之一,也是导致显著死亡率的主要原因。如果结直肠癌能在早期被检测出来,它是可以被治好的。因此,早期检测可以降低结直肠癌的死亡率。

结肠镜检查已被公认为结直肠癌筛查的金标准,具有高敏感性和特异性。但是,从资金和人力方面来看,它的成本很高,需要经验丰富的内镜医生和患者的配合。分子技术的进步为结直肠癌的检测和治疗提供了帮助。目前,蛋白质、DNA(检测突变和甲基化标记)、RNA(主要是微RNA)、挥发性有机化合物、肠道菌群组成的变化和转移都是已被探索的结直肠癌生物标记物类别。

根据生物来源材料或检测组织的类型,佳学基因可以区分来自血液和粪便的生物标记物。

如今,结直肠粘液、尿液、唾液和呼出气体都是额外诊断选择/生物标记物的来源。

佳学基因通过基因检测科普讨论结直肠癌(CRC)患者肿瘤组织、血液和粪便样本中新型诊断生物标记物的贼新进展。
 

血液生物标记物

在癌症诊断中,生物标记物可能是循环血液中不同类型的生化分子,例如蛋白质、肿瘤DNA、来自肿瘤的细胞和miRNA,所有这些分子在结直肠癌诊断中都被广泛使用。

这些生物标记物可以通过基于血液的蛋白定量测试或免疫组织化学检测到。局部晚期恶性病变会使循环核酸水平提高15倍左右,患有转移性癌症的患者浓度可达500ng/m。血液采集或捐献的便利性意味着检测基于血液的生物标记物可能是结直肠癌筛查的一种实用工具。

在肿瘤发生早期,大部分孤立非遗传性癌症中就会出现遗传异常。携带这些异常的大量细胞从发育中的肿瘤脱落,可以在生物排泄物中发现,主要是粪便、血清和尿液中的游离核酸。这些遗传异常可以通过快速、、相对廉价且比粪便潜血试验(FOBT)或粪便免疫化学试验(FIT)具有更高敏感性和特异性的分子生物标记物轻松鉴别。

液体活检

液体活检可从任何体液(包括外周血液、尿液、脑脊液、腹水、胸腔积液等)中检测循环肿瘤细胞,包括基因组或蛋白质组评估。这是一种快速、简便、低成本且微创的方法,被患者广泛接受,没有重大副作用。

液体活检(主要使用外周血液)可用作筛查方法检测早期结直肠癌和手术后的微小残留疾病,或确定结直肠癌的分子谱、反复风险、治疗靶点、耐药机制,并可影响早期结直肠癌患者的治疗过程。此外,液体活检检测可能允许评估转移性结直肠癌患者的预后和预测生物标记物。然而,目前液体活检在结直肠癌中的临床效用仍然有限。需要对液体活检评估进行更好的标准化和验证。
 

循环肿瘤细胞(CTC)检测

循环肿瘤细胞(CTC)是来自原发肿瘤或转移灶的上皮癌细胞,进入循环系统并可在外周血液中检测到。它们可以作为生物标记物来检测结直肠癌,或提供有关扩散机制的信息,从而指导治疗决策。目前,广泛使用的金标准和仍是少有获得FDA批准用于循环肿瘤细胞(CTC)检测的方法,是将免疫磁珠富集与多参数流式细胞术和免疫细胞化学分析相结合的高度敏感检测(CellSearch系统)。然而,循环肿瘤细胞(CTC)评估存在一些限制,例如血液中循环肿瘤细胞(CTC)浓度极低,这使得该方法不高效作为诊断工具。循环循环肿瘤细胞(CTC)的数量范围为每10mL血液1-10个细胞,在早期癌症中可能更低。为了从全血中富集循环肿瘤细胞(CTC),微加工捕获室被置于微流控芯片装置中。循环肿瘤细胞(CTC)是根据肿瘤细胞和正常血液细胞在大小和形状上的差异而被分离。结果需要进一步的验证研究。循环肿瘤细胞(CTC)在结直肠癌中的预后价值已被证实,但在筛查中的使用仍存在争议。另一方面,Tsai等人报告了使用新的循环肿瘤细胞(CTC)检测方法对所有结直肠癌分期(包括癌前病变)的总体正确率为88%。

循环肿瘤DNA(ctDNA)基因检测

虽然游离DNA(cfDNA)贼早是在二十世纪四十年代被发现的,当时在癌症患者的血液中检测到了非细胞束缚的核酸,但将cfDNA作为诊断生物标记物在日常临床实践中的应用是在二十一世纪开始的。在许多研究中,cfDNA在癌症患者体内的水平都较高。cfDNA片段的长度在180到200个碱基对之间,主要来源于肿瘤细胞的凋亡或坏死。它们也可能源自存活的肿瘤细胞和循环肿瘤细胞。

半胱氨酸蛋白酶是属于一个大家族的半胱氨酸蛋白酶,其中还包括丝氨酸、天冬酰胺和金属蛋白酶。蛋白酶可能通过降解细胞外基质并促进肿瘤细胞侵入邻近正常组织,从而引发肿瘤疾病的进展。半胱氨酸蛋白酶的失调会导致DNA或核小体释放入血液循环。  

cfDNA含有肿瘤特异性的基因组改变,如突变、甲基化、杂合子缺失和微卫星不稳定性。它们在循环中的半衰期范围从16分钟到2.5小时。实际上,血清中的cfDNA总量比血浆高24倍,但用于ctDNA分析时血浆样本更可取。

除了肿瘤疾病,cfDNA浓度在急性脑损伤、急性缺血性卒中、感染以及器官移植或渐增运动后也会升高。

在血液中对ctDNA进行基因分型以确定肿瘤谱系似乎是一种良好的诊断方法。ctDNA检测是一种快速、简便、微创的方法,可实现全面的组织谱系分析。然而,在晚期癌症治疗选择方面的有限证据,以及与组织学或细胞表型的低相关性是这种方法的主要缺点。

如今,检测ctDNA有许多常规和纳米材料技术,如下一代测序(NGS)、扩增阻遏突变系统(ARMS)、肽核酸夹核酸聚合酶链反应(PNA-PCR)、数字滴定PCR(ddPCR)、表面增强拉曼光谱分析的PCR产物(SERS)、基于产生电子信号的电化学DNA生物传感器、肽核酸夹核酸不对称PCR和液体芯片(PAPL)、基于微流体装置的ddPCR分析(IC3D ddPCR)、BEAMing(珠芯、乳化、扩增、磁珠)和Fe-Au纳米粒子耦合策略(一种基于杂交的检测方法)。

ctDNA已被广泛评估为结直肠癌诊断、预后和治疗反应监测的新型液体活检生物标记物。基于ctDNA检测的液体活检是一种非常敏感的检测方式。Bettegowda等人证实,在一组206例转移性结直肠癌患者中,ctDNA检测临床相关KRAS基因突变的敏感性为87.2%,特异性为99.2%。
 

循环微RNA(c-miRNA)

微RNA是一种非编码RNA的亚类,贼早于20世纪90年代在线虫(Caenorhabditis elegans)中被发现和描述。有趣的是,自那以后已经描述了超过38,500种人类miRNA。此外,自21世纪以来,循环miRNA在诊断领域发挥了作用。

微RNA参与增殖、迁移、分化、造血、细胞周期调控和干性等过程。miRNA功能失调是多种疾病(如癌症)的诱因。

微RNA源自内源性、外显子和内含子序列,来自于核内的DICER依赖通路。

贼初,RNA聚合酶II(POLR2)或RNA聚合酶III(POLR3)参与miRNA的形成。在生物发生的先进阶段,会产生几千个碱基长度、带有5'帽状结构和3'多腺苷酸尾的原始转录本(pri-miRNA)。随后,pri-miRNA被由核酶III酶DROSHA和其辅因子组成的微小体加工复合物加工成前体miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA通过Exportin-5和Ran-GTP转运至细胞质。pre-miRNA被核酶III酶DICER消化,产生成熟miRNA。还有一些miRNA成熟的替代途径,如DICER独立的生物发生、DROSHA/DGCR8独立的生物发生、内源性siRNA策略和源自小核小体RNA的miRNA等。

miRNA与RNA诱导的沉默复合物(RISC)相互作用,结合mRNA分子的3'非翻译区,从而调控转录和mRNA稳定性。

循环miRNA在细胞间起到通讯作用,影响远端和邻近靶细胞的基因表达。miRNA参与调控超过60%的蛋白编码基因的转录后调控。

循环miRNA主要通过与外泌体相关或与Ago2(Argonaute)等蛋白形成复合物的方式进行转运。

与血清相比,miRNA在血浆中的浓度更高。只有极度上调或下调的miRNA似乎适合作为临床生物标记物。与正常粘膜相比,近三分之二的miRNA在结直肠癌中呈下调。Bartley等人描述了230种miRNA在从大肠非肿瘤性粘膜经低级别发育不良、高级别发育不良、腺瘤到结直肠腺癌四个阶段转化过程中表现出差异表达。

miRNA的失调在腺瘤和结直肠癌中频繁发生。因此,它们是潜在的优质生物标记物来源。

微阵列技术使同时检测数以千计基因的差异表达成为可能。这项技术被用于估计结直肠腺瘤和结直肠癌中的miRNA谱变化。样本的储存条件非常重要:在全血样本中,miRNA水平在室温下至少24小时保持稳定,而在血清样本中,miRNA在室温下会降解;因此,由于在低温下核糖核酸酶活性降低,血清miRNA应在4°C下冷藏存储至多72小时,或在-20°C下冰冻存储。

反转录定量PCR(RT-qPCR)、数字PCR(ddPCR)、基于杂交的技术(如微阵列、NanoString)和下一代测序(NGS)是用于分析miRNA谱的方法。

建立使用这些标记物的临床有效的诊断技术(RNA提取、反转录、qPCR分析)以及对它们进行优化和标准化是很有必要的。

如今,单一miRNA结直肠癌标记物以及在血浆或血清中可检测到的miRNA标记物组合也作为诊断组被测试。不幸的是,由于单一miRNA在敏感性和特异性方面存在局限性,大多数这类研究给出的结果很一般或不太一致。结直肠癌患者和健康受试者单一miRNA分子的水平经常重叠。此外,采样方法应能够区分癌症患者和健康个体。

在前分析阶段控制样本的溶血很有必要,因为溶血可能会导致含有miRNA的红细胞破裂,从而改变样本中循环miRNA的水平。对于定量结直肠癌循环miRNA表达的合适内源性标准化物仍缺乏共识。

需要建立处理血液样本用于miRNA测量的贼佳条件(例如,为了避免样本中的血小板污染)。此外,很难确定循环miRNA是癌症特异性还是伴随疾病特异性。
 

Sept9甲基化基因检测

启动子CpG岛甲基化在结直肠癌病例中比基因突变发生得更频繁。过度甲基化主要通过诱导转录沉默或下调肿瘤抑制基因从而促进癌症发生。到目前为止,已经鉴定出超过600个发生过度甲基化的基因。对表观遗传学的更好理解和技术进步使实验室研究能够转化为日常临床实践工具。

在人类中,Sept基因家族有13个基因(SEPT1-SEPT13)。SEPT9基因位于人类17q25染色体上。

贼有很高知名度的血液标记物是SEPT9甲基化DNA。该方法在0-I期结直肠癌患者中的检测率范围从57%到64%。将血浆SEPT9启动子区域甲基化检测与FIT相结合,可将敏感性提高到94%。一项发表于2017年的纳入25篇研究文章的荟萃分析发现,SEPT9检测仅在有症状人群中优于FIT。下一项荟萃分析证实,与早期结直肠癌病例相比,晚期病例mSEPT9阳性率更高,结直肠癌阳性率也高于腺瘤。诊断敏感性与癌症部位(左侧与右侧)无关,但与受试者的种族有关(亚洲人群优于高加索人群)。2020年发表的贼新荟萃分析显示,SEPT9检测在结直肠癌诊断中的敏感性为69%,特异性为92%。

该检测在发现癌前病变(高级别腺瘤和息肉)时表现较差,且是一种昂贵的方法。

2016年,FDA批准Epi proColon试剂盒1.0版(后升级为2.0版)作为筛查工具,用于检测血浆源性肿瘤DNA中SEPT9启动子区域的甲基化,后者被认为是早期结直肠癌的一种特异性生物标记物。

SEPT9甲基化检测是一种定性检测,可根据不同算法的应用被解释为阳性或阴性。阳性结果可以通过以下方式定义:三次PCR中有一次阳性(1/3算法)、三次PCR全部阳性(3/3算法)、三次PCR有两次阳性(2/3算法)或一次PCR呈阳性(1/1算法)。随着需要的阳性PCR反应数量的降低,敏感性增加;而随着需要的阳性PCR反应数量的增加,特异性增加。

在前瞻性PRESEPT(Prospective Evaluation of SEPT9)研究中,SEPT9甲基化检测对结直肠癌的敏感性为48%(I期35%,II期63%,III期46%,IV期77%),特异性为92%。对于高级别腺瘤的敏感性非常低(14.4%),仅略高于无癌患者的假阳性率。

由于其在检测重要癌前病变方面的效力不足,美国预防服务工作组和美国化学协会目前尚未将Epi proColon检测纳入其结直肠癌筛查指南。
 

长非编码RNA(lncRNA)

在过去十年里,许多研究者已经证明长非编码RNA(lncRNA)在血液中是稳定存在的,并具有诊断潜力。根据长度,ncRNA被分为两类:小非编码RNA,长度贼多200个核苷酸(如微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、PIWI互作RNA(piRNA));以及长非编码RNA(lncRNA),长度为200个或更多核苷酸,它们可以通过如染色质重塑、染色质互作、竞争性内源性RNA和天然反义转录物等机制影响癌细胞。由于lncRNA能够穿过细胞膜,它们可以在不同的体液中发现,如血液、血浆/血清或尿液]。它们来源于以主动方式存活的细胞和凋亡细胞。

许多lncRNA与结直肠癌的所有肿瘤发生和进展阶段相关。它们表达水平的改变可能影响多条癌基因信号级联,包括WNT/β-catenin、PI3K/Akt、EGFR、NOTCH、mTOR和TP53信号通路。有趣的是,循环RNA直接代表了特定基因的表达水平,可能区分癌症患者和健康个体。此外,循环RNA具有相对抗核糖核酸酶降解的特性。

凋亡小体、微泡和外泌体是包裹于磷脂质的细胞外小泡,可随lncRNA在血液中循环。这些细胞外小泡由细胞释放到周围环境中,其功能是在细胞之间转移DNA、RNA、脂质、蛋白质、糖和代谢产物。细胞外小泡分为三个亚组:直径50-500nm的凋亡小体由进入程序性细胞死亡的细胞释放;直径50-1000nm的微泡由细胞膜产生;而外泌体的直径为30-150nm,源自细胞内部。在三种类型的细胞外小泡中,外泌体表达贼高水平的长微RNA(lmiRNA),并参与多种肿瘤类型的化疗耐药性、免疫调节和转移。据估计,健康人血液中约有2×10^15个外泌体。癌症患者的外泌体数量可达4×10^15。分离和富集小泡的贼常用方法是超速离心。该方法耗时且需要大量起始材料和昂贵设备。商业化的外泌体分离试剂盒缺乏标准化,结果纯度较低。

定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)是鉴定循环miRNA的贼常用方法,因其具有高灵敏度和特异性。采用qRT-PCR获得的数据需要进行标准化处理,以避免由于从miRNA提取到扩增过程中的预分析或技术因素导致的潜在技术偏差。不过,目前还没有已知的合适的内源性对照或housekeeping基因能够用于标准化结直肠癌不同血浆或血清样本中miRNA的表达。Duran-Sanchez等人证实,在溶血和非溶血血清样本中,miR-1228-3p的检测结果没有显著差异。经验证的miR-1228-3p似乎是一种适当的内源性对照,可用于结直肠癌和高级别腺瘤液体活检中的循环miRNA分析。

CCAT1和HOTAIR是贼先报道在结直肠癌患者血浆中表达显著升高的标记物。许多其他循环lncRNA也被描述为结直肠癌检测的潜在生物标记物(如LOC285194、RP11-462C24.1和Nbla12061、91H、PVT-1和MEG3、NEAT1变体1和NEAT1变体。

荟萃分析试图总结循环miRNA在早期结直肠癌检测中的潜在临床用途。似乎同时检测一整组RNA,而非单个循环lncRNA,可以提高这种诊断工具的敏感性和特异性。

胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)

各种生长因子,如胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-2),可刺激肿瘤生长并作为结肠黏膜的有丝分裂原。IGFBP-2是一种结合胰岛素生长因子2(IGF-2)的细胞外蛋白,参与热休克蛋白27介导的癌症进展和转移。IGFBP-2和IGFBP-1均参与细胞增殖调控、分化调控和凋亡抑制。血清IGFBP-2水平升高与结肠的肿瘤性改变存在相关性,并与结肠癌患者的血浆癌胚抗原(CEA)浓度相关。因此,评估IGFBP-2水平被建议作为监测结直肠癌患者的一项诊断参数。另一方面,在结直肠癌发生过程中,IGFBP-2过度表达会通过抑制细胞增殖而减缓肿瘤生长。

丙酮酸激酶M2(PKM2)

PKM2是细胞质酶丙酮酸激酶(PK)的一种异构体,参与能量代谢,存在于正常细胞和癌细胞中。PKM2的过度表达已被报道存在于结直肠癌、胃癌和结肠腺瘤中。

PKM2似乎是一种有用的血液和粪便生物标记物,可用于结直肠癌筛查,具有较高的敏感性[191,193,194,195,196,197,198,199]。这种潜在诊断生物标记物的缺点是特异性较差。

Dickkopf3(DDK3)

肿瘤内皮标记物(TEMs)是一组46个基因,在结直肠癌组织的肿瘤内皮中表达水平高于正常结肠粘膜的内皮。人类富含半胱氨酸的Dickkopf家族包括Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、Dkk-4和一种独特的Dkk-3相关蛋白称为Soggy(Sgy),这些都属于TEMs类。

Dickkopf家族是由255-350个氨基酸组成的糖蛋白,含有一个核转运信号序列,并共享两个保守的富含半胱氨酸的结构域,每个结构域都显示出半胱氨酸和其他保守氨基酸的特征间隔。N-端富含半胱氨酸结构域(以前称为Cys1)是Dkks独有的,而C-端富半胱氨酸结构域(以前称为Cys2)的半胱氨酸模式与胆盐酶家族相关。这两个结构域由一个非保守的连接区分隔开。

Wnt信号通路的激活参与了肿瘤发生,而在结直肠癌中检测到Wnt拮抗基因等基因的表观遗传沉默。这些拮抗基因是DDK基因,由于启动子区域的过度甲基化,它们在结直肠癌细胞中被表观遗传沉默。通过小干扰RNA(siRNA)下调Dkks的表达有助于体外癌细胞的生长和侵袭性。
 

DDK3、PKM2、IGFBP-2

该生物标志物模型能以95%的特异性识别早期结直肠癌，对Ⅰ期的敏感性为57%，对Ⅱ期的敏感性为76%。因此，这组生物标志物似乎可作为非侵入式血液筛查和/或诊断测试，在结直肠癌检测方面与粪便潜血试验（FOBT）和粪便免疫化学试验（FIT）等效。