【佳学基因检测】准确全面进行马凡氏综合征基因检测的方法与例子

佳学基因检测导读

原纤维蛋白-1 和原纤维蛋白-2 分别由FBN1和FBN2编码，在弹性纤维组装中发挥重要作用，其致病变异可导致多种结缔组织疾病，如马凡氏综合征 (MFS) 和先天性挛缩性蜘蛛指症 (CCD)。不同的基因组变异可能导致异质性表型特征和功能后果，因此不同患者会有不同的表现形式，这是错诊、误诊的重要原因。基因解码技术是一种新型的基于高通量测序的基因疾病病因鉴定技术，其特点是可以查出新的变异，数据库中未收录的变异，从而在幅度降低假阴性结果。可靠的变异结果可能指导对患者的护理并为其家人提供遗传咨询。马方氏基因检测对两名患有复杂先天性心脏缺陷的新生儿进行了临床表型分析。对于基因马方症基因解码基因检测，马方氏基因检测采用了新一代测序策略，包括对患有瓣膜功能不全、主动脉窦扩张、肾积水和畸形特征的婴儿 A 进行全基因组单核苷酸多态性 (SNP) 微阵列，以及对患有大动脉右位转位 (D-TGA) 和父母双方的婴儿 B 进行 Trio 全外显子组测序 (WES)。婴儿 A 是一名足月男婴，具有新生儿马凡氏综合征特征、左侧肾积水和复杂的先天性心脏缺陷，包括三尖瓣返流、主动脉窦扩张、卵圆孔未闭、动脉导管未闭、二尖瓣返流、三尖瓣返流、主动脉瓣返流和肺窦扩张。他出现了严重的持续性肺动脉高压和恶化的急性高碳酸性低氧血症性呼吸衰竭，并于生命第 10 天在同情拔管后死亡。细胞基因组全基因组 SNP 微阵列分析显示，FBN1基因内第 7-30 个外显子存在缺失，与新生儿马凡氏综合征相关的外显子缺失热点区域重叠。婴儿 B 是一名足月男性，产前诊断为孤立性 D-TGA。他在生命第 0 天需要进行球囊房间隔造口术，随后在生命第 5 天需要进行心房转换手术、房间隔缺损修复和动脉导管未闭结扎术。Trio-WES 显示FBN2基因中存在复合杂合 c.518C>T 和 c.8230T>G 变异。接合性分析证实，每个变异都遗传自健康的杂合携带者父母之一。自从他出生时接受心脏修复手术后，他一直健康地成长和发育，无需进一步住院治疗。马方氏基因检测的马方症基因解码基因检测重点介绍了新的FBN1/FBN2变异，并表明了患有复杂先天性心脏缺陷（有畸形特征和无畸形特征）的两个婴儿的表型-基因型关联。这些发现表明，下一代高通量基因组学对于新变异检测的重要性以及与FBN1/FBN2变异相关的表型变异性，特别是在新生儿时期，这可能会对临床护理和家庭咨询产生重大影响。

《准确全面进行马凡氏综合征基因检测的方法与例子》关键词

马凡氏综合征 (MFS)、新生儿马凡氏综合征 (nMFS)、先天性挛缩性蜘蛛指畸形 (CAA)、大动脉右位转位 (D-TGA)、全外显子组测序 (WES)、全基因组 SNP 微阵列

佳学基因为什么要推出马凡氏综合征基因检测

原纤维蛋白是一种富含半胱氨酸的大型糖蛋白，是细胞外基质 (ECM) 的主要成分，可融合成微纤维。原纤维蛋白微纤维是可延展的聚合物，可提供结缔组织弹性，广泛分布于组织和器官中。它们在弹性纤维形成过程中充当弹性蛋白沉积的模板，对维持血管、肺、皮肤和眼韧带等组织的完整性至关重要 。原纤维蛋白-1 中有一个富含脯氨酸的小结构域，而原纤维蛋白-2 中则有一个富含甘氨酸的结构域，这是原纤维蛋白-1 和原纤维蛋白-2 之间的主要区别。佳学基因基于《人类疾病发生的基因序列人体组分的结构与功能基础》，明确这些结构域在基质组装中的重要性，指出每种原纤维蛋白都由特定基因编码。两个原纤维蛋白基因FBN1和FBN2分别编码的蛋白质有 71.2% 的相似性，但可能在 ECM 形成中发挥不同的重要作用，这可能是不同表型表达的基础（表 1）。

表 1.与FBN1和FBN2致病变异相关的临床特征

以下是将内容翻译并以表格形式呈现的结果：

缩写说明：AD：常染色体显性遗传;CCA：先天性挛缩性蜘蛛指（趾）;FBN1：原纤维蛋白-1;FBN2：原纤维蛋白-2;MOI：遗传模式;MFS：马凡综合征

编码原纤维蛋白-1 ( FBN1 : MIM:134797) 的基因包含 65 个外显子，覆盖 200 kb 的基因组 DNA，位于 15q21.1 染色体上。原纤维蛋白-1 含有 47 个与人类表皮生长因子 (EGF) 相似的基序。在这 47 个 EGF 样基序中，共有 43 个呈现钙结合共识序列 (cbEGF) 。每个基序由六个半胱氨酸残基组成，这些半胱氨酸残基在 C1 和 C3、C2 和 C4 以及 C5 和 C6 之间形成二硫键，从而为其三维结构提供稳定性 （图 1）。钙与 cbEGF 结构域的结合为原纤维蛋白-1 提供了增强的稳定性、防止蛋白水解以及与 ECM 的多种成分进行通讯的结构元素 。这些钙结合 EGF 样基序的宽片段被由七个此类基序组成的一些重要结构域所打断，与潜在转化生长因子 β1 结合蛋白 (LTBP) 相似。

图 1.FBN1和蛋白质结构域示意图

FBN1致病变异会损害微纤维的形成，从而导致异常结缔组织的产生，从而引发马凡氏综合征 (MFS) (MIM:154700) ，这是由FBN1致病变异引起的最常见的遗传性疾病（表 1）。

FBN2基因位于 5q23-3 染色体上，长度超过 28 kb，有 65 个外显子，是在克隆位于 15q15-21.3 的FBN1基因座时确定的，该基因编码原纤维蛋白-2，这是一种含有 2912 个氨基酸的蛋白质，具有五个不同的结构域，长度与原纤维蛋白-1 相似。主要结构区包含 41 个钙结合表皮生长因子 (cbEGF) 样结构域 [ 13 ]（图 2 ）。原纤维蛋白-2 在发育早期表达，在成人组织中仅局限于骨和软骨基质，对弹性纤维的形成至关重要。FBN2 基因与FBN1具有很高的相似性；因此，据《人体心脏相关疾病的基因基础》，FBN2的致病变异会导致一种表型相关的疾病，称为先天性契约性蜘蛛指症 (CCA) (MIM:121050)（表 1），这种疾病也表现为马凡氏病体型和蜘蛛指症。由于 CCA 和 MFS 的表型相似，确定发病率和患病率已被证明是徒劳的。在此，马方氏基因检测描述了两例与FBN1和FBN2新变异相关的纤维蛋白病的表型特征和遗传变异。

图 2.FBN2和蛋白质结构域示意图

马凡氏基因检测过程、结果与分析解读结果

1、病史和临床病程

（1）案例A

患儿 A 出生于一家外地医院，母亲为 31 岁，来自于河北。妊娠 39 周，体重 3780 克。患者的产前病史包括早产心房收缩 (PAC) 以及左侧输尿管肾积水。婴儿通过预定的重复低位横切口剖宫产出生，出生后 1 分钟和 5 分钟的阿普伽评分分别为 3 分和 7 分。最初，他肌张力低下，没有哭声，心率约为 100 次/分。尽管最初以持续气道正压通气 (CPAP) 复苏至 100% 氧气补充，但婴儿仍然肌张力低下、屈曲姿势和去氧饱和，并伴有微弱的低沉哭声。他还听到了响亮的 4/6 全收缩期和舒张期杂音，并伴有明显的震颤。其余体格检查结果显示，患者肤色暗淡、皮疹、大头畸形、耳朵折叠且有皱纹、下颌紧咬、手指细长、双手紧握、身体姿势弯曲、手掌和脚底没有皱纹、脚和脚趾细长、胸腔形状异常（图 3 A-C）。

图 3.受检患儿 A 的临床特征提示新生儿马凡氏综合征

婴儿被送入新生儿重症监护室 (NICU) 接受心肺支持。他的胸部 X 光检查显示严重的心脏扩大（图 3C），他的动脉血气分析 (ABG) 因严重酸中毒而显著，pH 为 7.05，PaCO 2为 106 mmHg。初始出生后超声心动图检查显示右心室中度高血压，三尖瓣返流峰值压力梯度 (TRPG) 升高至 49 mmHg，主动脉窦扩张中度至重度 (Z = +6.5)，以及通过卵圆孔未闭 (PFO) 的双向心房分流、通过动脉导管未闭 (PDA) 的少量左向右分流、轻度至中度二尖瓣返流 (MR)、中度三尖瓣返流、轻度主动脉瓣返流和中度至重度肺窦扩张。尽管进一步使用了血管加压药、氢化可的松、表面活性剂和广谱抗生素治疗，他仍然持续出现严重肺动脉高压 (PPHN) 和低氧血症高碳酸性呼吸衰竭，平均氧指数 (OI) 为 60，因此在出生后第 3 天 (DOL) 被转移到马方氏基因检测的 NICU 进行进一步评估和治疗。

尽管将他的呼吸支持升级为机械通气并开始吸入一氧化氮以降低肺压，但他仍然低氧血症，平均氧饱和度水平约为 85%。DOL 3 的重复超声心动图显示严重的三尖瓣反流伴脱垂、中度至重度主动脉窦扩张（Z = +8.1）、严重的肺窦扩张以及新的左心室收缩期缩短轻度减弱（图 3D）。在腹部、肾脏和膀胱超声检查中，根据胎儿泌尿外科协会 (SFU) 分类，发现他患有 3 级左侧肾积水，无输尿管积水（图 3E）。他的 PPHN 对前列环素（曲前列尼尔、依前列醇）和西地那非有抵抗力。尽管进行了最大限度的药物治疗，但他仍然出现去氧饱和和低血压。根据其父母的要求，他的护理被转向患者的舒适护理。在 DOL 10 时，根据父母的要求，他在同情拔管后去世。图 4显示了先证者 A 的临床病程摘要。

图 4.患儿 A 的临床时间过程总结

（2） 案例B

患儿B的母亲为34岁的G4P2西班牙裔，孕期38周3天，体重3410克。患者在孕20周时通过胎儿超声心动图被产前诊断为大动脉右位转位(D-TGA)。婴儿通过正常的自然阴道分娩出生。生后1分钟和5分钟的阿普伽评分分别为9分和9分。婴儿出生时自发哭闹，生后5分钟仍出现明显的发绀。在NICU，他最初表现为反常低氧血症(即下肢氧饱和度高于上肢氧饱和度)。入院时胸部X光检查显示中度心脏扩大(图5A )，初始超声心动图显示PFO非常小，心房水平分流最小。鉴于已知 D-TGA 的情况下持续存在低氧血症，决定进行床边球囊房间隔造口术 (BAS)，同时持续输注前列腺素 E1 (PGE1) 以维持导管通畅，并计划在出生后第一周进行心房转换手术 (ASO)。患者耐受了房间隔造口术，没有任何并发​​症，重复超声心动图检查证实动脉导管较大，直径为 5.3 毫米 (图5B)。患者保持目标氧饱和度，DOL 1 时停用 PGE1，DOL 2 时重复超声心动图检查，现在显示动脉导管缩小，直径为 3 毫米。他的血流动力学保持稳定，直到 DOL 4，当时他出现低氧血症高碳酸性呼吸衰竭和低血压，分别需要机械通气和血管加压药支持。此外，在 DOL 6 时开始进行脓毒症检查和广谱抗生素治疗；他接受了 ASO、动脉导管结扎和 ASD 封堵术，没有任何并发​​症，术后入住儿科心脏重症监护室，使用血管加压药。超声心动图显示术后间歇性变化以及轻度至中度二尖瓣反流，估计 RVSP 为 45 mmHg 加上右动脉压，右肺动脉和左肺动脉狭窄分别为 45 mmHg 和 35 mmHg（图 5C）。在住院的剩余时间里，他毫无问题地撤掉了所有心肺支持，并连续进行超声心动图检查，直到出院时 DOL 为 20。

图 5.患儿B的临床特征

 

两名先证者的家族史均未发现近亲关系或其他患病家族成员。无心脏缺陷、心律失常或猝死病史。

2、基因检查（检测）

（1）先证者A细胞基因组全基因组SNP微阵列

该检测旨在检测拷贝数错误（丢失或增加）的改变以及表明杂合性缺失或丢失的拷贝中性改变（纯合性区域）。拷贝数变异分析按照美国医学遗传学和基因组学学院 (ACMG) 的建议进行。SNP 微阵列在FBN1染色体 15q21.1 的外显子 7-30 中发现了 107 kb 的间质缺失（表 2）。

表 2.通过SNP微阵列检测到了先证者A的FBN1缺失

（2）先证者B三重全外显子组测序

外显子组变异分析按照 ACMG 建议进行。总共在 216 个基因中发现了 8 个纯合变异（包括一个间隔 ~6 Mb）且不被认为重要或有贡献的变异，以及 212 个罕见的杂合蛋白质改变变异（VUS），这些变异具有不确定的临床意义。使用关键词先天性心脏缺陷、D-TGA、VSD（室间隔缺损）、ASD（房间隔缺损）或 PDA（动脉导管未闭），从人类基因突变数据库 (HGMD) 和在线人类孟德尔遗传 (OMIM) 生成了一个主要基因列表，未检测到与马方氏基因检测患者的先天性心脏缺陷相关的显著单核苷酸变异 (SNV) 或小缺失和插入（<10 bp）。然而，在FBN 2 中发现了具有不确定临床意义的复合杂合 c.518C>T 和 c.8230T>G 变异（表 3）。

表 3.通过三重WES检测到先证者B的FBN2复合杂合变异

基因检测与临床结果的综合分析

马方氏基因检测对两名婴儿进行了临床表型和基因组分析，患儿 A 为 nMFS，患儿 B 为 D-TGA，FBN1和FBN2分别存在新变异。

1、新生儿马凡氏综合征（nMFS）

MFS (MIM:154700) 是一种遗传性常染色体显性结缔组织疾病，主要表现在骨骼、眼部和心血管系统，也表现在肺系统、体膜和硬脑膜 [ 18、19、20、21 ] 。由于原纤维蛋白微纤维的普遍性，MFS 常常涉及多个器官系统 [ 22 ]。因此，FBN1 致病变异也会导致多种虽然重叠的遗传疾病（补充表 S1）。MFS 患者的临床变异性各不相同，nMFS 综合征是儿童早期最严重的表现 [ 23 ]。2016 年，已发现 1318 种与 MFS 相关的不同FBN1致病变异；然而，只有 59 个（4.8%）病例（包括 37 个错义突变（2.8%））与 nMFS 相关 [ 23 ]，这再次表明不同的基因型-表型关联可能决定新生儿 MFS（nMFS）与 MFS 临床表现的时间和严重程度 [ 23 ]。

新生儿马凡氏综合征 (nMFS) 是指出生时或出生后 3 个月内确诊的患者 [ 24、25、26、27 ]。早发型 MFS 是由没有家族史的新生变异引起的，其表型在产前、新生儿或婴儿期表现出来，早于经典 MFS 所见的表型 [ 28 ] 。相关表型特征包括关节挛缩、蜘蛛指、皮肤皱褶和晶状体异位 [ 24、25、26、27 ] 。与经典 MFS 相反[ 23、24、25、26 ] ，二尖瓣和/或三尖瓣功能不全导致的充血性心力衰竭是 nMFS患者出生后2年内死亡的主要原因。染色体异常，包括全基因缺失或外显子缺失和重复，很少发生（3.3%），但在采用多重连接依赖探针技术和阵列分析后，已发现染色体异常呈上升趋势[ 29 ]。

与其他已报告病例一样，马方氏基因检测的患者表现出 nMFS 的主要特征，包括呼吸窘迫、先天性心脏扩大、多瓣膜疾病、畸形特征和蜘蛛指。由于没有家族史，临床诊断采用表型和超声心动图标准。婴儿死亡后确认了基因诊断。全基因组 SNP 微阵列有助于识别涉及 15q21.1 内 15 号染色体的新型 107 kb 间质缺失，该缺失跨越FBNI的外显子 7-30。FBN1的这种致病变异[ NM_000138.5 ] 是新生的，之前尚未报道过。因此，马方氏基因检测的患者符合根特疾病分类学中定义的 MFS 诊断标准，该标准强调存在心血管、骨骼、眼部和皮肤表现，同时有FBN1突变或家族史[ 22 , 26 , 30 ]。尽管外显子 24–34 中的致病变异与新生儿 MFS 中异位晶状体的存在有关[ 31 , 32 ]，但该患者并无此特征。综合考虑临床特征与细胞基因组学检测，可以确诊为 nMFS。出生后第一年，急性早发型 MFS 的婴儿死亡率为 95%，且缺乏关于第三年和第四年生存率的数据[ 28 ]。

间质缺失区域与外显子 24-34 部分重叠，从而删除了FBN1基因的很大一部分，导致该基因的一个等位基因单倍体不足或功能丧失。马方症基因解码基因检测证实，一半正常的 FBN-1 蛋白拷贝不足以启动微原纤维蛋白的组装 [ 29，33 ]。因此，假设该区域在 FBN-1 蛋白的功能中起着至关重要的作用，导致该病发病较早且表现严重 [ 8，34，35 ]。马方氏基因检测患者的表型和疾病严重程度也可归因于新生儿区域（外显子 24-34）以外其他区域的突变。大约 92% 的患病个体有患病父母，25% 的先证者有新的改变 [ 30 ]。不幸的是，患者并未同意进行父母检测以评估缺失的可能来源。

尽管 nMFS 是原纤维蛋白病最严重的形式，但其诊断困难且在基因/表型上与经典 MFS 不同 [ 23、24、25、26 ] 。此前，多项报告表明，nMFS 患者的 FBN1 致病变异最有可能是新发的，主要位于外显子 24-32，被称为“热点”或新生儿区域 [ 8、34、35 ] 。最近，该区域变异致病的原因还被归因于 FBN-1 蛋白水解敏感性增加以及肝素结合功能的丧失 [ 23 ]，这可能影响微纤维的排列，使其融入聚合物微纤维中，这有力地表明该区域在弹性微纤维形成中起着至关重要的作用 [ 25 ]。还有少数报告称，nMFS 可能是由于该区域以外的致病变异引起的，外显子 4 中有两次报道，外显子 21 中有一次报道 [ 35 ]。TGFBR1 、TGFBR2、TGFB2、TGFB3、SMAD2和SMAD3等基因的遗传变异会导致 Loeys-Dietz 综合征，据报道会导致马凡氏样表型，FBN2和COL3A1的变异会导致先天性挛缩性蜘蛛指症和 Ehlers-Danlos 综合征 IV 型 [ 11 , 36 ]。此外，文献报道称，患有 MFS 表型的患者在涉及FBN1基因座的 15q21.1 染色体中存在缺失，并且其他基因也有缺失 [ 7 , 29 , 33 , 37 , 38 , 39 ]，所有这些缺失都与马方氏基因检测报告的导致 nMFS 的患者的缺失不同。

3.2. 先天性契约型蜘蛛指畸形（CCA）

FBN2中的变异与常染色体显性遗传 CCA 相关 [MIM:121050]。FBN2 中发现的致病变异在一个受限域中组装，类似于严重 MFS 致病变异在FBN1中组装的位置，主要在外显子 23 和 32 之间 [ 14 ] ，该区域编码 cbEGF 样结构域，并且可能发生在整个基因中，并且与 CCA 相关的这些致病变异的数量更多。致病变异导致可用于形成微纤维的 FBN-2 蛋白数量减少；因此，低水平的微纤维会降低纤维的弹性，导致 CCA 患者表现出症状 [ 14,16,40 ] 。目前，根据人类基因组突变数据库 (HGMD) 的记录，文献中仅报道了 91 种与 CCA 相关的FBN2基因致病变异 [ 41 ]。此外，截至本文发表时，尚未发现FBN2与先天性心脏缺陷（如大动脉右位转位 (D-TGA)）之间的基因型-表型相关性。

CCA 患者与 nMFS 有许多共同的特征；然而，CCA 患者没有表现出晶状体异位或主动脉根部扩张，这是主要的区别特征 [ 12 ]。CCA 的表型在家族内和家族间存在差异，不表现出地域或种族偏好 [ 42 ]。FBN2的致病变异也可能引发包括伴有主动脉病的 MFS、马蹄内翻足、黄斑变性和脊柱侧弯在内的疾病[ 42 ]。

马方氏基因检测报告了一名FBN2基因复合杂合突变患者。根据妊娠 20 周时的胎儿超声心动图，先证者 B 在产前被诊断为 D-TGA，并需要在 DOL 0 时进行 BAS，随后在 DOL 5 时进行 ASO、ASD 修复和 PDA 结扎。在对先证者 B 及其父母进行临床外显子组测序后，马方氏基因检测在FBN2中发现了新的复合杂合错义 c.518C>T 和 c.8230T>G (p.Tyr2744Asp) 变异。尽管FBN2中的变异与常染色体显性 CCD 有关 [ 43 ]，但文献中尚未报道过这两种变异在患有这种疾病或 CHD 的个体中出现。

变体 c.518C>T (p.Thr173Ile) 是从母亲遗传的，此前在一般人群中出现频率较低，而变体 c.8230T>G (p.Tyr2744Asp) 是从父亲遗传的，此前在一般人群中未观察到。这两个突变氨基酸不位于任何已知的关键域。使用两个独立的软件预测程序 (SIFT ( http://sift.jcvi.org/ ) 和 PolyPhen ( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/ )) 对这两个变体的致病性进行预测，结果并不一致。在原发基因列表和使用 HGMD 和 OMIM 注释的基因中，未发现有临床意义的 SNV 或小的缺失和插入，因此无法解释该患者所见的主要临床问题。先证者的父母为杂合子携带者，没有与患者临床表现相关的纤维蛋白原病的体征，家族史也没有发现近亲关系。

FBN2中大多数有临床意义的突变会导致致病性错义或剪接位点变异，这些变异通常通过改变关键结合位点（半胱氨酸）在编码 EGF 样结构域中几个氨基酸的基因中间部分组装，并导致蛋白质产物受到影响 [ 43 ]。表 4总结了文献中关于导致 CAA 并与患者未观察到的不同心脏缺陷相关的FBN2变异的报道。此外，据报道， FBN2中的基因内框内缺失也会导致强烈表达的突变 mRNA，这意味着编码的缩短蛋白质整合到 ECM 中并扭曲了原纤维蛋白 2 蛋白的正确折叠 [ 16,43 ] 。在另一份报告中，在健康个体中观察到外显子 1-8 内复发性基因内FBN2缺失。因此，这意味着单倍体不足可能不是主要的作用机制，而是FBN2突变体对野生型蛋白的显性负效应 [ 43 ]。据马方氏基因检测所知，这是第一例报告患有复合杂合FBN2变异且表现为与 CCA 无关的 D-TGA 的患者。

表 4.文献中报道了FBN2变异与CCA和先天性心脏缺陷有关

CCA：先天性挛缩性蜘蛛指症（Congenital Contractural Arachnodactyly）

• FBN1：原纤维蛋白-1基因

• FBN2：原纤维蛋白-2基因

• NA：未知或不适用

基因检测及基因解码所用材料和方法

1、人类马方症基因解码基因检测

所有人体马方症基因解码基因检测均按照加州大学洛杉矶分校 (UCLA) 机构审查委员会 (IRB) 的规定进行。所有受试者均提供书面知情同意书以参与本马方症基因解码基因检测。电子病历、家族史和标本采集均通过 UCLA 先天性心脏缺陷 (CHD) BioCore 按照 UCLA-IRB 批准的协议进行。所有标本在采集后均进行了去识别和编码。产前诊断是根据连续胎儿超声检查和超声心动图检查结果确定的。临床诊断是根据临床特征和超声心动图检查结果确定的。

2、细胞基因组 SNP 微阵列

在加州大学洛杉矶分校临床基因组学中心，根据临床验证的 CLIA（临床实验室改进修正案）和 CAP（美国病理学家协会）验证方案，使用从外周血单核细胞中分离的基因组 DNA (gDNA) 对患儿 A 进行 SNP 微阵列分析。全基因组单核苷酸多态性 (SNP) 寡核苷酸阵列用于评估测试样本中的拷贝数变异 (CNV)、插入、缺失、重复和基因组失衡。该检测使用 Affymetrix 全基因组 SNP 阵列 CytoScan™ HD（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 ThermoFisher Scientific）将患儿 A 的 DNA 与内部参考和来自 380 名正常对照的外部参考进行比较，以进行标准化和比较分析。该阵列平台包含 260 万个用于 CNV 检测的标记，其中 75 万个为基因型 SNP，190 万个为非多态性探针，可实现全基因组覆盖。分析使用 Affymetrix 染色体分析套件 (ChAS) 软件版本 3.1.0.15 (r9069) 进行。

3、Trio 全外显子组测序 (WES)

使用标准方法（Purelink 基因组 DNA 微型试剂盒，Invitrogen，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）从 UCLA 先天性心脏缺陷 BioCore 的外周血单核细胞 (PBMC) 中提取基因组 DNA。使用 CLIA 验证的方案，在 CCRD（加州罕见病中心）和 UCLA 临床基因组学中心进行文库制备、测序和数据分析。根据 Agilent Sure Select Human All Exon 50 Mb（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）Illumina 双端测序文库制备方案，对来自患儿和父母的基因组 DNA（3 µg）样本进行文库制备和外显子组捕获。在 Illumina HiSeq4000（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）上以 50 bp 双端运行进行测序。对于每个样本，生成了约 2 亿个独立配对读取，平均覆盖率为 RefSeq 蛋白质编码外显子和侧翼内含子 (+/- 2 bp) 的 140X，其中至少 95% 的碱基在 ≥10X 时被覆盖。使用 Novoalign 函数将序列与 hg19/b37 基因组发布比对。使用 Picard 标记 PCR 重复。基因组分析工具包 (GATK) 用于插入/缺失重新比对和碱基质量重新校准。使用 GATK 统一基因分型器调用 SNV (单核苷酸变异) 和小 INDEL (插入和缺失)。所有变异均使用 Ensembl 的定制 VEP (变异效应预测器) 引擎进行注释。使用 PLINK 确定血统纯合区域。公共数据库中次要等位基因频率 <1% 的罕见变异被保留以供进一步分析。

4、 变体分析

按照 ACMG/AMP 序列变异解释指南，根据候选稀有变异的接合性和遗传模式、其在基因内的位置、保守评分、群体和等位基因频率 (ClinVar)、蛋白质水平和结构域的预测结果、计算机工具的致病性预测、功能马方症基因解码基因检测和动物模型的证据以及疾病谱进行分类。所有变异均根据患者的表型进行解释。如果预测变异具有耐受性（对蛋白质结构或功能影响较小）或已在 GnomAD 数据库中报告，则将其排除。最后，使用 Integrative Genomics Viewer (IGV) v2.16.0确认候选变异的技术质量。

5. 基因检测的结果及意义

马方症基因解码基因检测报告了先证者 A 中首次发生的新型间质FBN1缺失。间质缺失对蛋白质的正常功能有重大影响，导致严重的 nMFS。马方氏基因检测患者所见的表型特征表明 nMFS 患者的基因型-表型关联，并详细说明了与 nMFS 临床特征相关的信息。虽然马方氏基因检测没有在先证者 B 中观察到 CCA 形式的原纤维蛋白病，但已报告FBN2突变中存在复杂的先天性心脏缺陷 (CCHD)。然而， FBN2变体中单独的 D-TGA 的意义仍有待观察，因为这种圆锥动脉病变通常与任何遗传异常或家族遗传模式无关。因此，FBN2复合杂合变体 c.518C>T 和 c.8230T>G（目前被归类为 VUS）可能共同代表一种可能的基因型-表型相关性。