【佳学基因检测】北京非综合征唇腭裂遗传病基因检测

遗传病基因检测关于疾病的介绍

非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）是全球最常见的先天性出生缺陷之一。根据《基因检测可以阻断遗传的遗传病》，每1000个新生儿就会有一例非综合征性唇腭裂。非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P可分为五种类型——（A）唇裂及牙槽裂，（B）腭裂，（C）不完全单侧唇裂合并腭裂，（D）完全单侧唇裂合并腭裂，（E）完全双侧唇裂合并腭裂——。佳学基因采用基因解码发现，这些类型均由人类胚胎发育第4到第10周间间充质组织在细胞迁移、增长、分化和凋亡中的异常造成。尽管这类畸形不是主要的死亡原因，但其对健康的终身影响以及对患者和家庭造成的巨大的经济和社会负担，使其治疗具有一定的困难。以往研究表明，非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的病因具有异质性，且与遗传和环境因素密切相关。然而，在遗传性非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家族中，单基因突变可能具有更重要的意义。关于非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家族中共享相关突变基因的研究较少。因此，识别易感变异在非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的预防、治疗和预后中具有重要作用。

全基因组测序（WGS）和全外显子测序（WES）是医学遗传学中最广泛使用和有效的基因组学方法，这些方法能够更全面地识别单核苷酸变异（SNV）、单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失突变（INDEL）、拷贝数变异（CNV）和结构变异（SV）。全基因组测序对所有基因进行测序，检测外显子、内含子和调控序列，筛选基因组中的遗传变异，支持基因型多样性分析、遗传进化分析、疾病发病机制研究和易感基因筛查。WGS在各种疾病的研究、筛查和监测中越来越多地被应用。致病基因鉴定基因解码使用WGS识别了基因与疾病之间的关联，基因检测机构通过WGS发现了高风险儿童癌症的可操作靶点。全外显子测序（WES）是一种更高效、完整、特异且经济的测序技术，用于研究遗传性疾病的病因。佳学基因等通过WES识别了非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P中的变异基因，发现易感基因不仅有助于揭示非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的病因，还帮助诊断和治疗非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P患者。许多基因解码探讨了非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的成因。这些基因解码基因检测表明，由于不同的遗传背景，不同人群可能有不同的致病变异。《唇腭裂的致病基因鉴定基因解码》总结了与出生缺陷病因相关的多种基因。有关中国人群非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P相关基因组位点突变的深入分析是佳学基因解码的重点关注课题

这一基因解码基因检测的病例分析通过测序技术对南方中国一个家庭中与非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P相关的de novo RESP18 rs2385404和rs2385405基因多态性进行了基因组分析。我们的发现为非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的病因提供了重要的见解。
 

非综合征唇腭裂遗传病材料与方法

参与者

佳学基因检测从广州医科大学附属医院所送检测的一个由5人组成的遗传性非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家族。成人及儿童的父母/监护人均提供了遗传病基因检测的知情同意。邀请了三名具有主治医师资格的整形外科医生进行临床检查和诊断。进行了全面的身体检查，以排除其他器官畸形、畸形，根据临床特征诊断为唇腭裂CL/P。考虑到来自同一遗传家族的5名受试者生活在相同环境中，因此在分析时认为5名患者的生活环境是相同的。整个基因检测分析符合医学伦理审查部的审查。

佳学基因检测从每位参与的家庭成员处获得了临床信息和外周血样本。五名成员参与了研究（见图1，黑色虚线矩形）。其中三名成员有完全唇裂合并腭裂，另外两名为正常对照（正常1和正常2）。父母分别为II3（Cleft 1）和II4（Cleft 2），两人均有单侧完全唇裂合并腭裂，而III2（Cleft 3）为有双侧完全唇裂合并腭裂的儿子。

• II3、II4 和 III2 是表现出 NSCLP 表型的个体（即患者）。
• I1、I2、I3、I4、II1、II2、II5、II6、III1、III3 和 III4 是家系中没有 NSCLP 表型的成员。
• II3、II4、III2、III3 和 III4 分别代表 Cleft_1、Cleft_2、Cleft_3、Normal_1 和 Normal_2。
• 黑色符号 表示受影响的成员。
• 箭头 指向家系图中的 proband（研究的起始个体）。
• 五名成员 参与了研究，这些成员在 图 1 中的黑色虚线矩形 内标出。

说明：

1. 具有 NSCLP 的家族成员：

   • II3、II4 和 III2 是表现出非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）表型的个体，说明这些人有该病，但没有其他综合征或先天性异常。

2. 没有 NSCLP 的家族成员：

   • 其他列出的家族成员（I1、I2、I3、I4、II1、II2、II5、II6、III1、III3 和 III4）则没有表现出 NSCLP 表型。

3. 家系图中的标记：

   • 黑色符号 代表家系中患有 NSCLP 的成员。
   • 箭头 指向 proband（研究起始个体），这个个体是研究的主要关注对象。
   • 五名参与者 被标出在家系图的 黑色虚线矩形 内，表示他们参与了该研究。

基因检测帮助下的家庭情况

非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）家系的临床表现：

• (A) (II3) 和 (B) (II4) 是拥有单侧完全唇裂和腭裂的父母，他们在手术后恢复情况。
• (C) (III2) 是有双侧完全唇裂和腭裂的儿子，他在手术前的情况。
• (D) 显示了 proband（研究的起始个体）手术后1年的临床特征。

说明：

1. 家族成员的临床表现：

   • (II3) 和 (II4) 作为父母，均有单侧完全唇裂和腭裂，并在手术后恢复了健康。手术后的恢复情况显示他们的病情得到了改善。
   • (III2) 是他们的儿子，在手术前患有双侧完全唇裂和腭裂，说明他的病情比父母更为严重。
   • (D) 中的图像展示了研究个体（proband）在手术后1年的临床特征，提供了关于手术效果和恢复情况的重要信息。

2. 基因检测的帮助：

   • 了解遗传因素：基因检测可以帮助确认是否存在遗传性因素导致 NSCLP，从而提供更多关于家族成员病情的背景信息。
   • 制定个性化治疗方案：基于基因检测的结果，医生可以为每位家庭成员制定个性化的治疗和康复计划，以提高治疗效果。
   • 评估遗传风险：通过基因检测，家族成员可以了解自己是否携带相关的遗传变异，帮助预测后代的遗传风险，制定相应的预防和干预措施。

总体而言，基因检测能帮助确定家族中非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）的遗传基础，为家族成员提供科学的遗传风险评估，并优化个体化治疗方案。

全基因组测序（WGS）和全外显子组测序（WES）由佳学基因医学技术（北京）有限公司（中国北京，www.jiaxuejiyin.com）执行。基因组DNA从患者的外周血中提取。使用RNA 6000 Nano LabChip试剂盒（Agilent，CA，美国）确保基因组DNA样品质量高，OD 260/280比率为1.8–2.0。使用高灵敏度DNA芯片试剂盒（Agilent，CA，美国）和Agilent SureSelect Human All Exon V6（Agilent，CA，美国）构建的DNA文库进行了测序，并在Illumina HiSeq2500/4000测序平台上运行。

在比对步骤中，测序读取通过Burrows-Wheeler比对器（BWA，牛津，英国）与参考基因组（UCSC基因组浏览器 hg19）对齐，然后通过Samtools（v1.3.1）进行排序，并通过Picard（v1.141）去除重复标记。在第二次后比对处理步骤中，进行局部读取重新对齐以修正插入缺失（indel）周围的潜在比对错误。由于插入缺失边缘附近的读取映射通常会导致错配碱基，从而产生假阳性SNP调用，局部重新对齐利用这些错配碱基确定是否应重新对齐，并应用计算密集型算法来确定读取相对于插入缺失的最一致位置，去除比对伪影。更多详细信息可从佳学基因医学技术（北京）有限公司（中国北京，www.jiaxuejiyin.com）。

变异检测

每个读取具有与测序错误概率相关的质量评分。由于系统性偏差，报告的质量评分已知不准确，因此在基因分型之前必须重新校准。重新校准后，输出BAM中的重新校准质量评分将更接近测序错误的概率[25]。

可以使用基因组分析工具包（GATK，https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices）生成变异调用，该工具包通过贝叶斯推断检查参考变异的证据。高斯混合模型适用于为每个假定变异调用分配准确的置信评分，并评估新的潜在变异。

变异注释

生物功能注释是找到遗传变异与疾病之间联系的关键步骤。使用SnpEff添加生物信息到变异集合中。使用ANNOVAR软件工具和内部代码对所有突变进行注释，并参考临床变异数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）。为了进一步筛选，使用1000基因组计划（http://www.1000genomes.org/）、外显子聚合联盟（ExAC）浏览器、SIFT（http://sift.jcvi.org）和PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）预测变异功能。

桑格测序

桑格测序由SJ-Bio有限公司（中国广州，www.saikabio.com）执行。使用Premier 3.0设计引物；引物序列见附表1。桑格测序产品通过ABI 3730遗传分析仪分离，数据使用Chromas V1.0.0.1进行分析。

非综合征唇腭裂遗传病基因检测结果

临床特征

受试者是一家来自南方的汉族家庭，具有家族性非综合征性唇裂和腭裂（见图1）。在该家庭中，II3、II4和III2是表现为非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P的先证者。I1、I2、I3、I4、II1、II2、II5、II6、III1、III3和III4是没有非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P表型的家族成员。在佳学基因检测分析的这一病例中，合计有5名成员，其中三人有完全性唇裂和腭裂，两人作为正常对照。所有患者均在广州医科大学附属医院的唇腭裂治疗中心进行诊断和治疗。其中II3（见图2A）和II4（见图2B）为父母，术后为单侧完全性唇裂和腭裂；III2（见图2C）为儿子，术前为双侧完全性唇裂和腭裂。图2D显示了先证者术后1年的临床特征。根据这些临床特征，使用全基因组测序和全外显子组测序检测可能的遗传损伤，以揭示疾病发生的基因原因，并帮助家族阻断这种多代发生的现象。

基因组测序

对非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P家庭的5名成员进行了全基因组测序（WGS）和全外显子组测序（WES）。WGS原始数据的质量因篇幅原因不在此处展示。Phred质量评分（Q），即基于错误率P的对数，描述了每个测序碱基的可靠性。例如，如果一个碱基正确率为99%，则质量值为20（Q20）；如果碱基正确率为99.9%，则质量值为30（Q30）。在WGS结果中，总有效数据范围为92.56亿碱基对（Gb），深度（x）为31.98到108.5亿碱基对（Gb），深度（x）为37.49。有效数据的平均比率为99.9%。Q20%、Q30%和GC%的平均比率分别为97.64%、93.70%和41.31%。WES原始数据的质量总结通过表格展示，此处省略。总有效数据的平均值为12.60亿碱基对（Gb），深度（x）为217.24。有效数据的平均比率为98.2%。Q20%、Q30%和GC%的平均比率分别为98.35%、95.47%和53.44%。在2×最小深度测量下，目标区域覆盖率为97.61%。在10×、20×和30×测量下，目标覆盖率分别为96.04%、92.15%和85.00%。因此，深度和覆盖率应足以可靠地检测大多数目标区域内的DNA变异。

遗传发现

使用1000基因组计划、外显子聚合联盟（ExAC）浏览器、SIFT和PolyPhen-2对结构变异功能进行了注释。结果筛选出总计7624个突变，包括WGS队列中的1754个突变（23.0%）和WES队列中的123个突变（1.6%）。WGS、WES和临床变异数据库的综合分析显示，在3个研究队列中共有9个位点变异（RESP18、LSR、SPATS2L、ZNF277、IHH、C2orf69、KIR3DL1、MUC3A和PRKAG3）（见图5）。在这些变异位点中，发现RESP18基因中的2个突变位点（rs2385404和rs2385405），这些突变位点与唇裂和腭裂相关，并且在非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）P患者中同型突变伴有更严重的症状，这些突变是非同义单核苷酸变异（SNVs），导致功能变化。由于未发现类似的错义变异，例如某些是同义变异或与RESP18调控内分泌特异性蛋白18关系较小，排除了8个突变。为了验证WES检测到的DNA序列变异，使用了标准方法桑格测序。

桑格测序

通过桑格测序，在所有5名家庭成员中检测到了RESP18基因（NM_001007089.4）的2个变异位点（rs2385404和rs2385405）。桑格测序验证显示，rs2385404和rs2385405的突变与WGS和WES结果一致。桑格测序结果表明，RESP18的突变（rs2385404，c.90G>T，p. Glu30Asp）导致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu转变为Asp。桑格测序结果还表明，RESP18变异（rs2385405，c.157G>A，p. Glu53Lys）导致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu转变为Lys。这两个变异均为错义变异。因此，这一结果确认了RESP18基因变异是该家系中的致病变异。

非综合征唇腭裂遗传病基因检测结果的解释与说明

Sanger测序确认了RESP18基因序列（GRCh38.p14 chr2）中的变异（rs2385404和rs与2385405）。

• (A) Sanger测序显示，RESP18基因的突变（rs2385404，c.90G>T，p. Glu30Asp）导致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu（谷氨酸）变成了Asp（天冬氨酸）。

• (B) Sanger测序结果显示，RESP18变异（rs2385405，c.157G>A，p. Glu53Lys）导致RESP18蛋白的氨基酸序列中Glu（谷氨酸）变成了Lys（赖氨酸）。

在这个结果中，Glu – 谷氨酸，Asp – 天冬氨酸，Lys – 赖氨酸。

解释：

1. 变异的确认：

   • rs2385404 和 rs2385405 是在RESP18基因中的两个已知变异位点，Sanger测序技术确认了这些变异的存在。

2. 具体的突变信息：

   • (A) rs2385404变异（c.90G>T）表示在RESP18基因的第90位碱基由G（鸟嘌呤）突变为T（胸腺嘧啶），导致RESP18蛋白的第30位氨基酸由Glu（谷氨酸）变为Asp（天冬氨酸）。这种氨基酸的改变可能影响蛋白质的功能。
   • (B) rs2385405变异（c.157G>A）表示在RESP18基因的第157位碱基由G（鸟嘌呤）突变为A（腺嘌呤），导致RESP18蛋白的第53位氨基酸由Glu（谷氨酸）变为Lys（赖氨酸）。这同样可能对蛋白质功能产生影响。

3. 氨基酸变化的意义：

   • Glu（谷氨酸） 和 Asp（天冬氨酸） 都是酸性氨基酸，但它们的化学性质略有不同，这种变化可能影响蛋白质的结构或功能。
   • Lys（赖氨酸） 是碱性氨基酸，替换掉Glu（谷氨酸）可能会显著改变蛋白质的电荷和功能。

总体来说，这些变异可能会对RESP18蛋白的功能产生影响，进而对与该基因相关的生理过程或疾病风险产生潜在影响。基因检测结果有助于理解这些变异的具体作用及其可能的临床意义。

佳学基因检测唇腭裂基因检测的优势

非综合征性唇裂合并腭裂（NSCLP）是中国最常见的先天性畸形之一，其中近20%为家族性病例。NSCLP与多种因素相关，其发病机制并非为很多临床医生所知晓。本病例分析认为，易感基因与胚胎发育过程中腭部形态发生异常和组织融合的NSCLP密切相关。通过连锁分析、基因组重排、候选基因以及全基因组关联研究（GWAS）等多种方法，研究人员发现了与NSCLP相关的关键基因。例如，SATB2和IRF6基因上发现的几个变异与NSCLP的原因密切相关。基因解码通过GWAS研究识别了41个具有全基因组显著性的SNPs，这些SNPs位于14个基因（RAD54B、TMEM19、KRT18、WNT9B、GSC/DICER1、PTCH1、RPS26、OFCC1/TFAP2A、TAF1B、FGF10、MSX1、LINC00640、FGFR1和SPRY1）的26个基因座上。致病基因鉴定分析过程中进行了非洲的全基因组测序（WGS）分析，识别了162个高置信度的致病性新生突变（DNMs）。基因解码对来自独立家庭的个体进行全外显子组测序（WES），建议5个候选基因（ACACB、PTPRS、MIB1、GRHL3、CREBBP）的稀有变异可能与NSCLP风险相关。通过聚合酶链反应和Sanger测序对GWAS中与欧洲人群NSCLP密切相关的Vax1基因的rs7078160进行基因分型，并通过病例对照和家系关联研究比较了突变。因此，NSCLP可能与候选基因的突变有关。

在本病案中，佳学基因检测使用了全基因组测序（WGS）和全外显子组测序（WES）来识别在东南部汉族NSCLP家族中的易感变异。在这个家族中，父母（II3和II4）有单侧完全唇裂和腭裂，而III2有双侧完全唇裂和腭裂。基因组分析显示该NSCLP家族中RESP18基因存在2个突变。巧合的是，患者II3和II4具有杂合突变，而III2具有纯合突变。唇腭裂致病基因鉴定基因解码的结果表明，NSCLP的表型差异和严重程度与RESP18基因突变相关。进一步的Sanger测序结果也得出了相同的结论。因此，唇腭裂致病基因分析认为RESP18是NSCLP发展的一个重要基因，并且与腭裂的严重程度相关。

调节性内分泌特异性蛋白18（RESP18）是一种18千道尔顿的蛋白，主要存在于内质网（ER）中。作为促肾上腺皮质激素分泌途径中的重要糖皮质激素反应蛋白，RESP18受多巴胺、糖皮质激素和胰岛素等生理和药理刺激的调节。此外，RESP18参与调节边缘系统和自主功能，调控细胞骨架和神经突生长，从而通过转录后O-糖基化影响器官发育。因此，RESP18可能是面部颌部发育的重要环节，其异常表达对唇裂和腭裂的发生有重大影响。

总之，NSCLP的发生率和病情与RESP18基因突变相关。基因解码认为推测RESP18基因在唇裂和腭裂的发病机制中扮演着重要角色，并且该基因可能与NSCLP家族的病因预测有关。

创新性说明：

1. 应用全基因组测序（WGS）和全外显子组测序（WES）：

   • 本案例采用WGS和WES技术来识别NSCLP的易感变异，这是相对于传统方法（如GWAS和单一基因分析）的一种创新。这种方法提供了更全面的基因组信息，有助于发现那些可能被遗漏的变异。

2. 发现RESP18基因的相关性：

   • 研究发现RESP18基因的突变与NSCLP的严重程度相关，这一发现明确了RESP18在NSCLP中的作用。这一发现有助于进一步理解NSCLP的遗传机制，并提供了新的研究方向。

3. 对表型和基因型的关联分析：

   • 通过将表型（如唇裂和腭裂的类型和严重程度）与基因型（如RESP18的突变类型）进行详细关联分析，研究揭示了基因变异如何影响临床表现。这种方法的创新性在于将遗传变异与具体的临床特征直接关联，为个体化治疗提供了依据。

4. 潜在的临床应用：

   • 研究结果提示RESP18可能作为NSCLP的生物标志物，用于早期预测和风险评估，这对临床诊断和预防具有重要意义。