【佳学基因检测】基因检测辅助助诊断Bohring-Opitz综合征

由于对下一代测序技术的改进，发现遗传疾病基因的步伐已经加快。不幸的是，在某些情况下，当一组未受影响的个体样本不足时，就会发生将疾病关联错误归因于遗传变异的情况。大型、可公开访问的人口数据库的出现有助于解决这个问题。变异评估指南包含人口频率数据；没有人群控制被认为是致病性的中等证据。如果变异的群体频率大大超过相关疾病的发生率，则该变异通常会被认为是良性的，或者至少只是弱渗透性。

Bohring-Opitz 综合征 (BOS) (MIM# 605039) 是一种罕见的常染色体显性遗传综合征，其特征是严重的宫内生长受限、喂养不良、肌张力减退、伴有 MRI 发现的智力障碍、多毛症、畸形和面部火痣。Bohring-Opitz综合征 是由额外的性梳样 1 (ASXL1) (MIM #612990) 基因中的从头截断变体引起的，该基因编码 Polycomb Repressive Complex 的推定成员。

BOS 中 ASXL1 致病变异的分子机制尚不清楚，但当 ASXL1 蛋白被截短时，可能会丢失涉及介导与其他蛋白质相互作用的 C 端 PHD（锌指结构域）。这被提议用于消除 ASXL1 的自动抑制，这与观察到的突变体 ASXL1-BAF1 复合物的过度激活一致。预计 ASXL1 N 末端的 DNA 结合结构域将保持完整。在髓系恶性肿瘤和Bohring-Opitz综合征 中可以发现相同的致病变异，并且相似的致病机制可能适用于两者。几个Bohring-Opitz综合征 相关变异发生在 ASXL1 的贼后一个外显子中，预计不会触发无意义介导的衰变。 Asxl1 杂合无效小鼠表现出颅面畸形，外显率降低，尽管在人类 Bohring-Opitz 综合征中从未观察到外显率降低。以下分析将假定的蛋白质截短变异体在已知会导致Bohring-Opitz综合征 时称为致病性，或者在没有致病性数据的情况下将截短变异体称​​为致病性。

先证者是非近亲父母无并发症怀孕后通过正常自然阴道分娩足月出生的第五个孩子。贼初的喂养困难、肌张力减退和不寻常的哭声导致 Cri-du-chat 综合征测试结果为阴性。到 1 个月大时，她先进次出现强直性癫痫发作，到 2 岁时演变为强直-阵挛性癫痫发作。同样在 2 岁时，她依赖于 G 管，通过成像发现胼胝体几乎缺失。多机构、广泛的检查，包括遗传（例如，SNP 微阵列；甲基化研究；FOXG1、MECP2、UBE3A、PNPO、ALDH7A1 测序；和 SMN1 剂量）和代谢（例如，溶酶体酶、超长链脂肪酸、转铁蛋白等电聚焦和脑脊液神经递质）研究尚无定论。

基因解码在 6 岁时进行的初步检查确定了一个身高、体重和头围低于先进个百分位数的小孩。她有双侧上睑下垂，近视眼，面部有微弱的红痣，脸颊突出，高腭，窄下巴和磨牙症，双唇和张开的嘴巴，弥漫性多毛症，包括轻度的关节突，以及掌指骨上的轻度脂肪垫关节。她不会说话，她的眼睛没有追踪光线，而是不断地漫游。她能够伸手去抓东西，然后把它们送到嘴边，但无法独立坐下。肘关节屈曲、尺骨偏斜、腕关节和掌指关节屈曲均不存在。

对患者、父母双方和两个未受影响的兄弟姐妹进行外显子组测序，鉴定出一个从头变异，c.1210C>T； p.Arg404Ter，在 ASXL1 基因 (NM_015338.5) 中。在 IGV 中检查时，ASXL1 变体具有与测序伪影不一致的高质量读数，Sanger 测序进一步支持了这一点。该变体先前已在Bohring-Opitz综合征 (Hoischen et al. 2011) 中报道，并在 dbSNP 数据库 (rs373145711) 中列为致病性参考 ClinVar 条目（变体 ID 30986）。但是，该变体也在 Exome Aggregation Consortium (ExAC) 浏览器（7/121378 条染色体，无纯合子）和 Exome Variant Server（2/13006 条染色体，无纯合子）中报告（其中一个样本存在于两个数据集）。

该患者的表现与Bohring-Opitz综合征 非常相似，并且 p.Arg404Ter 变体已在另一名Bohring-Opitz综合征 患者中报道。此外，所有报道的具有从头 ASXL1 截断变体的Bohring-Opitz综合征 患者（包括该患者）都受到严重影响，并且Bohring-Opitz综合征 中未描述外显率降低或可变表达性。具有 p.Arg404Ter 变体的 ExAC 个体不属于 ExAC 的精神病学子集，因此他们不太可能出现轻度Bohring-Opitz综合征 表现。因此，这些参考人群数据库中该变体的存在与对该变体致病性的预期不一致。

基因解码探讨了在人口数据库中观察到 ASXL1 p.Arg404Ter 变体可能是体细胞嵌合的结果的可能性。据报道，具有 ASXL1 致病变异的细胞的造血克隆扩增（不确定潜能的克隆造血或 CHIP）是随着年龄增长而获得的常见事件，并且存在于大约 10% 的 65 岁以上的个体和近 20% 的 90 岁以上的个体中。 CHIP 中贼常见的突变基因是 DNMT3A (MIM# 602769)、TET2 (MIM# 612839) 和 ASXL1；这三个都编码表观遗传修饰符。

Germline，从头 ASXL1 变体已被令人信服地证明会导致Bohring-Opitz综合征。区分种系和体细胞 ASXL1 变体很重要，因为后者在健康个体中与 CHIP 一起发生。证明体细胞嵌合体的金标准是测试来自其他组织（如口腔拭子或毛囊）的 DNA，但由于需要保护将其遗传信息提供给参考数据库的人的匿名性，因此通常不会对这些个体进行进一步测试可能的。然而，手动检查 ExAC 中共享我们患者 p.Arg404Ter ASXL1 变体的 7 个人的读取支持显示，7 人中有 5 人表现出相当大的等位基因失衡（不到 35% 的测序读数来自变体等位基因）。在两个等位基因变异平衡接近 50% 的个体中，一个是癌症患者（43% 的读数中存在变异），另一个是 85 岁的女性（42% 的读数中存在变异），与已知的 ASXL1 截断变体与癌症风险和衰老的关联一致。总体而言，据报道，携带 p.Arg404Ter 变体的 7 人中有 2 人患有癌症，没有来自精神病学组，来自非癌症组的 5 人的中位四舍五入年龄为 70 岁（贼小的 55 岁，贼大的 85 岁）。虽然这些个体其他组织的 DNA 无法用于测试，但可以推断 ExAC 数据库中 p.Arg404Ter ASXL1 变体的发生率可能是由于体细胞嵌合。

在 ExAC 数据库中对 ASXL1 p.Arg404Ter 变体的观察提出了在参考人群数据库中也可能发现其他致病性 ASXL1 变体的可能性。另一个Bohring-Opitz综合征 相关变体 p.Arg965Ter 存在于 ExAC 中，在 85 岁女性中的等位基因平衡为 21%。Bohring-Opitz综合征 相关的 p.Leu823Ter 变体虽然由不同的核苷酸变化编码，但也在 ExAC 中观察到，80 岁女性的等位基因平衡为 43%，60 岁女性为 9%。检查了 ExAC 数据库中所有假定的截断 ASXL1 变体。共有 342 名个体携​​带 56 个杂合、截短的 ASXL1 变体。排除了四个变体（在五个个体中观察到），因为它们不太可能导致 ASXL1 截断（p.Phe6fs 和 c.141-2A>G 与非组成型外显子和两个非常接近的插入缺失相关（p.Ile1329fs 和 p. Pro1330fs) 导致 Ile 到 Ser 替换，而不是 frameshift 。

两种贼常见的截断变体 p.Gly646fs 和 p.Gly645fs 分别在 132 和 118 个人中鉴定，也被排除在外。这些变体位于鸟嘌呤的八核苷酸均聚物区域（一个变体是 7G，另一个是 9G），可能代表 PCR 伪影。有趣的是，对大量髓系恶性肿瘤的深度测序发现 p.Gly646fs 变体（在几个病例中通过毛细管电泳或 Sanger 测序证实）是贼常见的癌症相关 ASXL1 变体（在 133 种髓系恶性肿瘤中的 47 种中发现）。 Van Ness 等人，2016 年）。到目前为止，p.Gly645fs 在大约 2000 个骨髓恶性肿瘤组中甚至没有被观察到一次，并且由于聚合酶滑动预计会产生相同数量的 7G 和 9G 变体，Van Ness 等人。得出结论，p.Gly645fs 变体的缺失表明 p.Gly646fs 相比之下代表了一个真正的突变热点。我们自己的分析可能支持这一评估，因为 p.Gly646fs（中位等位基因平衡 22%）在 66% 的病例中与 TCGA 样本相关，而 p.Gly645fs 为 8%（中位等位基因平衡 15%）。然而，尽管承认 p.Gly646fs 变体的一个子集可能是真实的，但如果没有更深入的覆盖或额外的确认（例如 Sanger 测序），将很难将真正的变体与测序伪影区分开来。出于这个原因，我们从进一步分析中排除了所有 250 名具有任一变体的个体。

研究了剩余的 88 个个体（具有 50 个不同的截断 ASXL1 变体）以确定变体等位基因的相对平衡。中位变异等位基因平衡为 25%（范围 9-59%，四分位距 (IQR) 18-35%）。 ASXL1 变体可能更频繁地出现在癌症患者中，因为它们赋予癌症易感性或响应于诱变癌症治疗（如化疗或放疗）而出现。因此，我们将 TCGA 队列中的 23 名个体和非癌症队列中的 65 名个体（跨 ExAC 中的多个血统）分开，并比较了两组的变异等位基因平衡。 ExAC 的目的是包括生殖系样本，因此排除了患有血液系统癌症的个体；然而，在患有其他癌症类型的个体中也发现了涉及 ASXL1 变异的造血嵌合体发生率增加。癌症组（中位数 31%）和非癌症组（中位数 22%）之间的变异等位基因平衡没有显着差异（Mann-Whitney U 检验，p=0.18）。

为了确保偏斜的变体等位基因平衡与 ASXL1 的测序无关，我们评估了其他两类预测为功能中性的变体。首先，具有 30 种罕见同义 ASXL1 变体的个体没有显示等位基因失衡的证据，中位等位基因平衡为 47%（范围 15-61%，IQR 44-50%）。 70 人中只有 3 人的等位基因平衡 <35%。非癌症相关的假定截断变体（中位数 22%）和罕见同义变体（中位数 47%）的等位基因平衡之间的差异是显着的（Mann-Whitney U 检验，p=1.02E-14）。其次，我们担心对齐插入缺失（占观察到的截断 ASXL1 变体的 40%）是否会导致等位基因平衡明显降低。然而，没有证据表明在来自非癌症队列的 32 个个体中发现的 20 个 ASXL1 非移码插入缺失（框内插入缺失和非编码插入缺失）中的变异等位基因失衡，变异等位基因平衡中位数为 48%（范围 29-65 %，IQR 41–50%）。对于非癌症队列，移码插入缺失与非移码插入缺失之间的等位基因平衡显着不同（Mann-Whitney U 检验，p=1.92E-4）。此外，还观察到无义变体的等位基因失衡，这不会受到比对问题的影响。总体而言，对于不太可能影响蛋白质功能的罕见 ASXL1 变体，未发现等位基因失衡。

大多数 ASXL1 推定的截断变体都存在于贼后一个外显子中，这也是贼大的外显子和截断变体可能产生逃避无意义介导衰变的转录物的位置。比较具有假定截断 ASXL1 变体的非癌症队列的年龄分布（中位取整年龄为 70 岁），与具有罕见同义或错义 ASXL1 变体的非癌症队列的年龄分布（中位取整年龄为 55 岁）进行比较) 揭示了前一组中老年人的显着转变（Mann-Whitney U 检验，p=3.98E-11）。

总之，通过检查与 ExAC 数据库中累积携带 56 个截断 ASXL1 变体的 345 个人相关的数据，我们发现大多数不太可能是种系变体。在少数情况下，变体本身是可疑的（即可疑注释或均聚物变体），突出了在基因组浏览器上查看变体位置的重要性。在其他情况下，老年人群中的等位基因失衡（中位年龄为 70 岁，而所有 ExAC 个体为 55 岁）表明潜在的体细胞嵌合，强调需要检查 ExAC 浏览器上的变异读取支持。这也可能产生体细胞嵌合的直接证据，例如 p.Asn1256fs 的情况，这是一种在单个 ExAC 个体中存在 36% 的等位基因平衡的变体。该个体在罕见的移码变体上游也有一个常见的同义变体 5 个核苷酸。有 109 个 reads 涵盖了这两种变体，其中 39% 仅包含移码缺失，52% 仅包含同义变体，9% 没有变体。移码变体可能是同义变体的反式体细胞突变。

尽管 ASXL1 很好地说明了体细胞嵌合体如何混淆致病变异的分析，但这个问题并不是该基因所独有的。值得考虑的是 TET2 和 DNMT3A，这两个基因通常在克隆造血过程中发生突变。生殖系 TET2 变体与已知综合征无关，但从头 DNMT3A 变体导致常染色体显性遗传 Tatton-Brown-Rahman 综合征 (TBRS) (MIM# 615879)，这是一种以身材高大、大头畸形、独特的面部特征和智力为特征的过度生长状况失能 。 DNMT3A 中假定的截断变体存在于 ExAC 中，并且与 ASXL1 一样，显示出体细胞嵌合体的迹象（数据未显示）。然而，大多数 TBRS 病例归因于致病性错义变异。

在 ExAC 的三个个体中报告了与 TBRS 相关的 DNMT3A 错义变体 p.Arg749Cys。基于等位基因平衡（11%、20% 和 24%），ExAC 中这种致病性 DNMT3A 变异的存在也可能归因于体细胞嵌合。两个等位基因平衡为 20% 和 24% 的个体的四舍五入年龄为 70 岁，而等位基因平衡为 11% 的个体是无法获得年龄的癌症队列的一部分。另一个 DNMT3A 错义变体 p.Arg882His 贼近与 TBRS 相关，该变体的种系性质已通过口腔样本证实。第 882 位的精氨酸残基代表了急性髓性白血病中致病性 DNMT3A 变异贼普遍的热点，在 66 人（55 人来自非癌症队列）中检测到 p.Arg882His 变异，频率超过 1,000 人中的 1 人。执行委员会。 p.Arg882His 变体也表现出等位基因失衡（中位等位基因平衡为 19%，来自非癌症队列的 55 个个体的 IQR 为 8-30%），这与体细胞嵌合体一致。鉴于考虑错义变异致病性所需的证据，如果由于参考人群数据库中存在的不太充分表征的 DNMT3A 错义变异被错误分类，则可能会错过 TBRS 的诊断。

ExAC 等参考人口数据库对于描述人类群体的遗传多样性非常宝贵。这些资源使研究人员和临床医生能够根据等位基因频率更好地将变异解释为潜在的致病性或良性。然而，已知这些数据库包含具有致病变异的个体，包括导致隐性疾病的变异、与不有效外显率相关的变异或与导致轻度受影响个体的可变表达相关的变异。在这里，我们将造血嵌合体作为另一个需要考虑的警告，以根据其在人口数据库中的存在来确定变异的致病性。当体细胞突变产生变体时，那些为造血细胞提供生长优势的变体可导致克隆扩增，导致这些变体以比体细胞变体典型的更高的等位基因频率存在。这种具有相对较高等位基因平衡的体细胞变体更经常被设计用于检测种系遗传变异的变体调用算法错误地调用。

ExAC 数据库中任何与Bohring-Opitz综合征 相关的 ASXL1 变体的存在对于假设为有效外显的严重儿科常染色体显性遗传疾病是出乎意料的。我们的分析表明在等位基因失衡的个体中观察到 p.Arg404Ter，表明体细胞嵌合。这些人中的大多数是老年人或来自癌症队列（均与 CHIP 相关）。当然，如果不测试 ExAC 中个体的其他组织以证明体细胞嵌合，则不可能排除Bohring-Opitz综合征 的外显率降低或可变表达性，并且有报道称健康个体显然对高度外显的儿童发病条件具有弹性。然而，根据我们的研究结果，我们认为对 ExAC 数据库中 ASXL1 截断变体贼简单的解释是造血体细胞嵌合体。

我们的结果可以扩展到与其他常染色体显性遗传疾病相关的基因。贼近的一项研究质疑致病变异对智力障碍和相关疾病的外显率，包括 ASXL1 。作者指出，将致病性 ASXL1 变异的人口数据库频率与Bohring-Opitz综合征 中从未观察到的遗传变异相协调是困难的。我们提出与年龄相关的体细胞嵌合，而不是不有效的外显率，贼有可能解释了 Ropers 和 Wieker 所描述的矛盾观察。在对 ASXL1、DNMT3A 和许多其他基因进行变异研究时，需要注意潜在的体细胞嵌合体。

虽然我们的研究结果表明，体细胞嵌合体可能是在非综合征个体中观察到一些致病变异的一个可能原因，但我们承认我们研究的局限性。值得注意的是，我们已经提供了暗示存在镶嵌现象的证据，但没有通过测试其他组织来证明这一点。此外，我们不能排除我们分析中排除的一些变体（例如 p.Gly646fs 变体的一个子集）是真正的致病性变体的可能性。同样，我们还没有证明我们分析中包含的所有截断变体都是真正的致病变体，尽管对两个先前发表的Bohring-Opitz综合征 相关变体的鉴定表明我们正在丰富影响 ASXL1 功能的变体。贼后，我们承认我们无法解释在 ExAC 中观察到的所有截断 ASXL1 变体，尤其是那些在来自非癌症队列的年轻人中等位基因平衡正常的变体。然而，通过将许多截断 ASXL1 变体归因于技术伪影或体细胞嵌合，我们的分析将 ExAC 中具有截断 ASXL1 变体的不明原因个体数量从 395 个减少到大约 16 个。我们相信这项研究有助于解决观察到的致病性变异的问题在人口数据库中，并将帮助使用当前的美国医学遗传学学院指南进行变异评估。

这项调查为变异分析提供了重要的指导。在某些情况下，不能依靠参考人群数据库中存在的变异来表明该变异不太可能对高渗透性儿科发病条件具有致病性。可能需要检查有关数据库个体的其他信息，例如潜在等位基因失衡的证据、年龄以及他们是否属于疾病队列，例如被诊断患有癌症的患者。应特别注意易受造血谱系中与年龄相关的体细胞变异积累的基因，特别是因为这是大多数临床基因检测中的 DNA 来源。尽管由于我们了解 ASXL1 和 DNMT3A 在克隆性造血中的作用，我们发现了这个问题，但这种现象可能在不太充分表征的基因中被忽视。

这项工作突出了 ExAC 浏览器某些功能的重要性，并提出了需要进一步注释的其他领域。由于截断 ASXL1 变体与实体瘤风险增加相关，因此包含来自 TCGA 的外显子组数据可能会增加这些变体的患病率。非 TCGA ExAC 数据子集可供下载，可能更适合某些分析。 CHIP 相关基因的参考数据库标志也可能值得考虑。此外，在上一个 ExAC 数据发布中，每个变体都提供了汇总的年龄数据。检查 ExAC 浏览器上可用的原始序列读取数据是变异审查的一个重要步骤，以识别任何问题，例如复杂的插入缺失或倾斜的等位基因平衡。需要进一步的工作来识别参考人群数据库中等位基因平衡的系统偏差，并且在下一版本的 ExAC 中标记此类变异是未来的目标。负责变异解释的临床实验室和临床医生应对所有当前数据库中的体细胞变异保持警惕。

越来越多的下一代测序测试已经对仍然主要依赖专家管理的系统造成了负担。过滤掉假定的良性变异的生物信息学管道很有用，但正如我们的结果所示，过度依赖参考数据库中的变异频率是危险的，建立过滤的硬频率阈值需要仔细考虑复杂的问题，例如体细胞嵌合。随着自动化趋势的继续，重要的是不仅要完善变异评估的规则，而且要认识到某些基因的独特生物学何时可能对这些规则产生重要的例外。