【佳学基因检测】关于非小细胞肺癌小样本生物标志物基因检测的分析、报告和质量评估

 

基因检测报告的分析、报告和质量评估导读

非小细胞肺癌 (NSCLC) 的诊断工作需要生物标志物测试来指导治疗选择。本文是由两部分组成的系列文章中的第二篇。在第 1 部分中，非小细胞肺癌基因检测正确性如何才能达到最高课题组总结了获取和处理晚期非小细胞肺癌患者的小样本样本（即分析前步骤）的循证建议。在第 2 部分中，非小细胞肺癌基因检测正确性如何才能达到最高课题组总结了与非小细胞肺癌中小样本样本的生物标志物检测（以及相关的报告和质量评估）的分析步骤相关的循证建议。随着可操作（遗传）靶点和已批准靶向治疗的生物标志物数量不断增加，使用下一代测序（NGS）同时测试多个可操作致癌驱动因素变得势在必行，正如欧洲医学肿瘤学会指南所述。这在晚期非小细胞肺癌中尤为重要，在晚期 NSCLC 中，组织标本通常有限，与序贯生物标志物检测相比，NGS 可能有助于避免组织衰竭。尽管有指南建议，但在获得新一代测序技术方面存在显着差异，这主要是由于报销限制。使用越来越复杂的测试方法也对结果报告产生影响。分子检测报告应包括临床解释，并酌情对样本充分性进行附加评论。建议使用分子肿瘤委员会来促进对高通量测序基因检测产生的复杂遗传信息的解释，并共同确定非小细胞肺癌患者的最佳治疗方案。最后，无论采用哪种测试方式，

关键词： 外部质量评估，液体活检，分子诊断，二代测序，非小细胞肺癌

 

非小细胞肺癌基因检测介绍

非小细胞肺癌基因检测正确性如何才能达到最高课题组应该测试谁？

生物标志物检测现在对于指导晚期非小细胞肺癌 (NSCLC) 的治疗决策至关重要，欧洲医学肿瘤学会 (ESMO) 指南建议“所有患有晚期、可能、很可能或确定的腺癌的患者都应该接受检测致癌驱动因素”。此外，建议对年龄小于 50 岁的非腺癌组织学（例如鳞状细胞癌）患者进行分子检测  以及从不吸烟者、长期戒烟者或轻度吸烟者（< 15 包年）。该策略是由找到可操作更改的相对概率驱动的。如第 1 部分 ，越来越多的证据表明，与接受化疗的没有可操作驱动突变的患者相比，接受靶向治疗的具有可操作致癌驱动突变的患者临床结果有所改善。

非小细胞肺癌基因检测正确性如何才能达到最高课题组应该测试哪些生物标志物？

晚期非小细胞肺癌的临床设备目前包括 7 个欧洲药品管理局 (EMA) 批准的具有相关生物标志物的靶向药物（不包括程序性死亡配体 1 [PD-L1]；见表​​​1) 。这些可操作遗传靶点的生物标志物现在包括表皮生长因子受体 ( EGFR )外显子 18、19 和 21 的致敏突变、Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物 ( KRAS ) p.G12C点突变、B-Raf 原癌基因 V600E点突变 ( BRAF p.V600E )，以及涉及间变性淋巴瘤激酶 ( ALK )、ROS 原癌基因 1 ( ROS1)、神经营养酪氨酸受体激酶 (NTRK1、2 和 3 )的重排，并在转染过程中重排 ( RET ) 。正如 ESMO 指南中所述，目前大多数欧洲国家都认为检测EGFR突变和重排涉及ALK和ROS1是强制性的 。随着一线 B-Raf/丝裂原活化蛋白激酶 (MEK) 抑制剂得到更广泛的批准，许多肿瘤学服务也强制要求进行BRAF p.V600E突变检测 。在欧盟委员会于 2022 年 1 月批准 sotorasib 后， KRAS p.G12C现在成为欧洲可行的遗传靶点 。NTRK是许多欧洲国家批准治疗的靶点，而 Erb-B2 受体酪氨酸激酶 2/人表皮生长因子受体 2 ( ERBB2/HER2 ) 和肝细胞生长因子受体 ( MET ) 外显子 14 跳跃突变是不断发展的靶点/生物标志物。ESMO 正确医学工作组制定了 ESMO 分子靶点临床可操作性量表 (ESCAT)，以帮助临床医生优先考虑各种遗传靶点的可操作性 。ESCAT I 级改变意味着药物已在临床试验中得到验证，因此，改变应推动日常临床实践中的治疗决策。ESMO 建议使用下一代测序 (NGS) 对肺腺癌患者的所有 I 级改变进行分析。

表格1:欧洲已建立和新兴的非小细胞肺癌生物标志物

预测性生物标志物	NSCLC 腺癌中的估计频率e	指南推荐的测试技术	EMA 批准的靶向治疗h
EGFR突变_	15% f	任何适当的、经过验证的技术，但须接受外部质量评估	阿法替尼、达克替尼、厄洛替尼、吉非替尼、奥希替尼
KRAS p.G12C突变	13%   25–33%（所有KRAS突变）	聚合酶链反应；焦磷酸测序；新一代测序	索托拉西布_
ALK重排	5%	FISH（历史标准）；IHC（针对 FISH 验证）；新一代测序仪	阿来替尼、布加替尼、色瑞替尼、克唑替尼、劳拉替尼
ROS1重排	2%	FISH（经试验验证的标准）；IHC 选择确认 FISH；新一代测序仪	克唑替尼、恩曲替尼
NTRK重排	< 1%	免疫组化；鱼; 聚合酶链反应；新一代测序	恩曲替尼、艾罗替尼
BRAF突变b	2%	任何适当的、经过验证的技术，但须接受外部质量评估	达拉非尼、曲美替尼
RET重排	2%	任何经过验证的测试（例如 FISH；PCR；NGS）	赛培替尼
PD-L1 表达水平c	≥ 50% TPS：33%   1–49% TPS：30%  < 1% TPS：37%	免疫组化	单独使用免疫检查点抑制剂（pembrolizumab、nivolumab、atezolizumab、cemiplimab）或联合化疗
新兴生物标志物	NSCLC腺癌的估计频率	潜力测试技术	正在研究的靶向治疗
MET外显子跳跃突变	3%	免疫组化；鱼; 新一代测序	卡博替尼、卡马替尼j、k、克唑替尼、MGCD265、tepotinib j、l、m
ERBB2/HER2突变和扩增	2%	新一代测序	Ado-trastuzumab emtansine、afatinib、dacomitinib、fam-trastuzumab deruxtecan-nxki k,j、trastuzumab、mobocertinib
NRG1重排	< 1%	新一代测序仪	阿法替尼、GSK2849330、AMG 888、司利班单抗、泽诺库珠单抗
FGFR1	数据不可用	新一代测序仪	BGJ398，罗加替尼

 

表格改编自 Kerr 等人。版权所有 © 2021 作者。由 Elsevier BV 出版 保留所有权利。根据知识共享署名 4.0 国际 (CC BY 4.0) 许可条款复制

ALK间变性淋巴瘤激酶，BRAF  B-Raf 原癌基因，EGFR 表皮生长因子受体，EMA 欧洲药品管理局，ERBB2  Erb-B2 受体酪氨酸激酶 2，FDA 食品和药物管理局，FGFR1 成纤维细胞生长因子受体-1，FISH 荧光原位杂交，HER2 人表皮生长因子受体 2，IHC 免疫组织化学，KRAS  Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，MEK 丝裂原活化蛋白激酶，MET 肝细胞生长因子受体，NGS新一代测序，NRG1 neuregulin-1，NSCLC非小细胞肺癌，NTRK神经营养酪氨酸受体激酶，PD-L1 程序性细胞死亡配体 1， 转染过程中重排的RET ， ROS1  ROS 原癌基因 1，PCR 聚合酶链反应，TPS 肿瘤比例评分

^a预测对酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗的反应

^b预测有/无 MEK 抑制剂对 BRAF 的反应

^c预测对免疫疗法的反应

^d作为预测性生物标志物正在研究中，目的是为患者确定合适的治疗方法

^e在超过三分之一的案例中没有特定的驱动程序已知

^f外显子 19 缺失、外显子 21 p.L858R突变和外显子 20 插入分别约占所有突变的 10%、6% 和 2.5%

^g新兴技术

^h截至 2022 年 1 月

ⁱ其他直接 KRAS。^G12C抑制剂正在研发中，包括 adagrasib（MRTX849；FDA 突破性疗法指定）、GDC-6036、JNJ-74699157、JDQ443、LY3537982、D-1553

^j FDA 批准

^k在日本获得批准

^l正在接受EMA审核

^m根据早期获得药物计划在英国获得批准

除了可操作的遗传靶标的生物标志物外，免疫组织化学 (IHC) 的 PD-L1 表达对于通知免疫检查点抑制剂的治疗选择是必不可少的（表​​​（表格1）1) 。ESMO 指南规定了一线治疗中肿瘤比例评分≥50% 的强制性阈值 ；肿瘤比例评分定义为PD-L1+肿瘤细胞数除以存活肿瘤细胞总数，再乘以100% 。然而，生物标志物分析的定义和阈值没有标准化；对于 PD-L1，至少有五种检测方法可用，它们具有特定的评分系统和肿瘤部位适应症 。研究表明，其中一些针对非小细胞肺癌的检测结果高度一致 。然而，新兴生物标志物的检测标准化是一项挑战，需要所有利益相关者共同努力，以确保生物标志物引导的靶向治疗在未来取得成功。

由于有丰富的靶向治疗药物，EMA 批准的可操作靶标生物标志物的数量将在未来几年增加。这些包括MET外显子 14 跳跃突变和基因扩增、ERBB2/HER2突变和扩增、neuregulin-1 ( NRG1 ) 重排、成纤维细胞生长因子受体 1 ( FGFR1 ) 和EGFR外显子 20 插入 。针对这些基因的药物正在研究中，其中一些已经在某些国家获得批准（见表​​​表格11）。

靶向药物开发的快速创新步伐体现在非小细胞肺癌正确肿瘤学的当前和未来状态，这使得临床指南和相关实践难以跟上步伐。数字 1表明当前建议与主要国际生物标志物测试指南中批准的疗法之间的差距越来越大。

图1：国际指南对a和b新兴生物标志物的建议摘要 。图改编自 Kerr 等人。版权所有 © 2021 作者。由 Elsevier BV 出版 保留所有权利。根据知识共享署名 4.0 国际 (CC BY 4.0) 许可条款复制。^a NCCN 肿瘤学临床实践指南（NCCN 指南^®）为某些应测试的个别生物标志物提供建议，并推荐测试技术，但不承认任何特定的商业上可用的生物标志物测定或商业实验室，^b生物标志物检测^{NCCN 指南®}推荐KRAS和RET，^c NCCN 指南^®不推荐 TMB 检测。ALK 间变性淋巴瘤激酶，AMP 分子病理学协会，ASCO 美国临床肿瘤学会，BRAF B-Raf 原癌基因，CAP 美国病理学家学院，EGFR 表皮生长因子受体，ERBB2  Erb-B2 受体酪氨酸激酶 2，ESMO 欧洲学会用于内科肿瘤学，HER2 人表皮生长因子受体 2，IASLC 国际肺癌研究协会，IHC 免疫组化，KRAS  Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，MET 肝细胞生长因子受体，NCCN 国家综合癌症网络，NTRK 神经营养酪氨酸受体激酶，PD-L1 程序性细胞死亡配体 1，RET 重排期间转染，ROS1 ROS原癌基因1，TMB 肿瘤突变负荷

国家指南和报销决定的变化进一步扩大了现实世界实践和技术创新之间的差距，这在时间和结果方面通常与最初的 EMA 批准有很大不同。Kerr 及其同事最近的一篇综述 说明了欧洲国家之间在现实世界生物标志物测试实践方面的显着差异（图 2）。，强调在某些地区和国家对非小细胞肺癌患者进行生物标志物检测的情况仍然不理想。

图 2：晚期或反复性非小细胞肺癌生物标志物检测的国家特定指南摘要 。图改编自 Kerr 等人。版权所有 © 2021 作者。由 Elsevier BV 出版 保留所有权利。根据知识共享署名 4.0 国际 (CC BY 4.0) 许可条款复制。ALK 间变性淋巴瘤激酶，BRAF  B-Raf 原癌基因，EGFR 表皮生长因子受体，ERBB2  Erb-B2 受体酪氨酸激酶 2，HER2 人表皮生长因子受体 2，KRAS  Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，MET 肝细胞生长因子受体，新一代测序 新一代测序，NRG1  neuregulin-1，NSCLC 非小细胞肺癌，NTRK 神经营养酪氨酸受体激酶，O可选，P先进，PD-L1 程序性细胞死亡配体 1，RET 转染过程中重排，ROS1  ROS 原癌基因 1 , TMB肿瘤突变负荷。NTRK在有限的情况下也通过了测试^；在英格兰，可以通过癌症药物基金获得针对其他生物标志物的一些靶向疗法。^b考虑其他分子检测，具体取决于临床或药物可用性。^c NTRK、KRAS、MET、RET和ERBB2 / HER2将包含在当前版本中。^d目前未指出将这些生物标志物用作单独的测试；相反，建议将它们包括在最初在所有晚期非小细胞肺癌中进行的扩展面板中，或者在之前的EGFR / ALK / ROS1 / BRAF测试为阴性时进行。^e如果患者无法进行活检或组织分子分析结果无法提供信息，建议进行液体活检测试。^f EGFR液体活检仅在无法进行组织活检时进行评估。^g对不符合反射标准的病例进行按需检测（例如，对于具有一些提示性临床特征的鳞癌[年轻、不吸烟等]）

非小细胞肺癌基因检测正确性如何才能达到最高课题组应该如何评估非小细胞肺癌中的生物标志物？

7 种 EMA 批准的生物标志物导向非小细胞肺癌疗法（不包括检查点抑制剂）和新兴靶向疗法的可用性表明，将多重、大规模并行测序技术（即 NGS）作为治疗患有晚期非小细胞肺癌。NGS 能够同时测试多个致癌驱动因素 ，并提供一种方法来应对越来越多的可操作目标和有限的可用组织量（如第 1 部分所述）。NGS 可以分析临床相关的共突变，例如丝氨酸/苏氨酸激酶 11 ( STK11 )、kelch 样 ECH 相关蛋白 1 ( KEAP1 ) 和肿瘤蛋白 p53 (TP53 ) 和涉及 1/2 型乳腺癌 ( BRCA1/2 )的 DNA 损伤反应途径改变。其他新出现的新抗原负荷和免疫治疗反应预测因子，如肿瘤突变负荷 (TMB)、综合基因组分析 (CGP) 和 DNA 甲基化，也可以通过高通量测序基因检测进行分析。随着可评估生物标志物的数量不断增加，并行或顺序运行多个独立检测在时间和成本方面变得越来越低效，最终使天平向有利于新一代测序技术的方向倾斜。因此，最近的 ESMO 指南指出，对于某些肿瘤类型（例如肺腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胆管癌的 I 级改变），使用新一代测序技术进行分子检测更可取，并且高通量测序基因检测正迅速被采用作为识别具有致癌靶标的肺腺癌的标准方法 。然而，尽管目前有指南建议，但在欧洲 的高通量测序基因检测访问/使用方面仍存在显着差异，其中报销限制是采用生物标志物测试最佳实践的关键限制。

在本系列的前一篇文章中，非小细胞肺癌基因检测正确性如何才能达到最高课题组探讨了与获得足够质量的组织进行生物标志物测试相关的挑战和基于证据的建议。在这篇综述（第 2 部分）中，非小细胞肺癌基因检测正确性如何才能达到最高课题组总结了与晚期非小细胞肺癌患者小样本生物标志物检测的分析、报告和质量评估相关的循证建议。如果没有指南或文献明确描述最佳实践，非小细胞肺癌基因检测正确性如何才能达到最高课题组会根据作者组的经验报告非小细胞肺癌基因检测正确性如何才能达到最高课题组对最佳实践的建议。

 

生物标志物测试方法

单基因或多重方法？

生物标志物测试方法分为两类：DNA 和/或 RNA 的单基因或多重测定（即新一代测序技术或多重聚合酶链反应 [PCR]）。单基因检测方法包括通过实时定量 PCR (qPCR) 进行 DNA 测序、焦磷酸测序或桑格测序、通过逆转录酶 (RT)-PCR 进行 RNA 测序、通过 IHC 检测细胞蛋白表达以及通过（荧光）原位杂交（[F]ISH）。适当的诊断方式取决于感兴趣的分子靶标，如表中所示​​​表 2。 涵盖表中所有生物标志物的测试​​​表2，宽面板下一代测序技术测序比使用 IHC、FISH 和 PCR 组合的多个独立生物标志物测试更具成本效益（承认 IHC 是目前唯一高效的 PD-L1 评估方法，是ALK的先进方法， FISH 证实了模棱两可的结果）。与这一预期一致，研究表明，当需要测试多个靶标时，NGS 比单基因测试更具成本效益 ，并且与单基因测试相比，NGS 的使用增加与寿命延长相关- 晚期非小细胞肺癌患者获得的年 。总体而言，NGS 代表了单基因检测的有效替代方案 。

表 2:针对当前和新兴的非小细胞肺癌预测性生物标志物的推荐分析方法

生物标志物	类型	分析技术
EGFR前 18、19、21	突变	DNA-SEQ (PCR/NGS)
KRAS p.G12C	突变	DNA-SEQ (PCR/NGS)
ALK	融合	IHC 和 FISH、DNA-SEQ、RNA-SEQ (PCR/NGS)
MET外显子 14 跳跃	突变/重排	DNA-SEQ (PCR/NGS)/RNA-SEQ/FISH
表皮生长因子受体前 20	突变	DNA-SEQ (PCR/NGS)
BRAF p.V600E	突变	DNA-SEQ (PCR/NGS)
ERBB2/HER2	突变	DNA-SEQ (PCR/NGS)
RET	融合	FISH、DNA-SEQ、RNA-SEQ (PCR/NGS)
ROS1	融合	IHC 和 FISH、DNA-SEQ、RNA-SEQ (PCR/NGS)
NRG1	融合	FISH、DNA-SEQ、RNA-SEQ (PCR/NGS)
NTRK1, 2, 3	融合	IHC 和 FISH、DNA-SEQ、RNA-SEQ (PCR/NGS)
PD-L1	表达	免疫组化

 

ALK 间变性淋巴瘤激酶，BRAF B-Raf 原癌基因，  EGFR表皮生长因子受体，ERBB2 Erb-B2 受体酪氨酸激酶 2，FISH荧光原位杂交，HER2人表皮生长因子受体 2，IHC免疫组化，KRAS Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物MET肝细胞生长因子受体NGS二代测序NRG1 neuregulin-1 NSCLC非小细胞肺癌NTRK神经营养酪氨酸受体激酶PCR聚合酶链反应，PD-L1程序性细胞死亡配体 1，转染过程中RET重排， ROS1 ROS 原癌基因 1，SEQ测序

DNA还是RNA？

虽然目前基于 DNA 的高通量测序基因检测在理论上可用于检测致敏突变（点突变、缺失和插入）、拷贝数变异和结构重排（基因融合），但依赖基于 DNA 的融合检测存在错误风险当大的内含子区域位于融合伙伴之间时，与缺失相关融合相关的负面影响 。基于 DNA 的新一代测序技术分析的灵敏度可能受到NTRK等基因内含子区域大小的限制，因为断点通常发生在大内含子区域内 。然而，就假阴性错误率而言，用于文库制备的各种系统之间存在差异。与 DNA 相比，RNA 测序不受转录过程中剪接的内含子区域的影响。因此，作者建议将基于 RNA 的高通量测序基因检测与基于 DNA 的下一代测序技术并行使用，以帮助提高检测基因融合的灵敏度。技术的选择也很重要，因为混合捕获分析和锚定多重技术允许更广泛的融合分析，但比基于扩增子的方法需要更多的材料 。此外，基于 RNA 的新一代测序技术允许鉴定基因转录本，从而得出关于功能齐全的框内基因融合的结论，以及基因融合伴侣的鉴定。就对可用组织的潜在影响而言，RNA 和 DNA 的一步共提取以及 DNA 和 RNA 的同时新一代测序技术可以帮助减少组织消耗。

IHC 在检测基因融合方面有作用吗？

应该承认，特别是在融合基因检测的情况下，IHC 可以补充和/或替代测序或 FISH 检测；然而，根据作者的经验，还应考虑这些方法的费用和组织消耗。有时，当由致癌融合基因驱动时，在肿瘤细胞中观察到蛋白质水平升高。通过 IHC 检测基因产物过表达是评估非小细胞肺癌中ALK、ROS1和NTRK融合的有用筛选工具。这种方法在 ESMO 指南  中得到推荐，美国食品和药物管理局已批准 Roche VENTANA ALK (D5F3) CDx IHC 测定作为 ALK 激酶抑制剂的主要治疗确定测试。对于ROS1和NTRK IHC + 病例，必须通过另一种分子方法（例如 FISH、qPCR、NGS）进行确认 。对于RET融合，不建议将 IHC 作为筛查工具，因为已报告假阳性和假阴性病例 。总之，结合 DNA/RNA NGS，使用经过适当验证的分析并由合格的操作人员处理，是一种高效且有效的方法，用于全面检测晚期非小细胞肺癌中所有已批准和新兴的生物标志物（不包括 IHC 检测的 PD-L1）。在融合基因检测方面，IHC 可能还有其他作用。IHC 可能适用于肿瘤细胞少或非肿瘤细胞污染高且高通量测序基因检测失败或不可行的样本。在适当的组织学背景下，强 IHC 染色可能在临床上直接可行（例如对于 ALK 融合）或强烈指示融合基因（例如 ROS1 和 NTRK）的存在。也有证据表明该蛋白的存在（阳性 IHC）可能表明对治疗有更大的临床反应的可能性。，表明 IHC 可能与用于融合基因鉴定/检测的分子方法互补。

组织活检还是液体活检？

通过液体活检对血浆循环游离 DNA (cfDNA) 进行测序是基于组织的生物标志物检测的补充方法，特别是当组织样本不足以或不适合/不适合生物标志物检测，或者无法安全地进行再活检时。根据作者的经验，cfDNA 测序分析可以使用在室温下储存在乙二胺四乙酸 (EDTA) 管中的 6 mL 外周全血进行。理想情况下，在 EDTA 管中收集的血液需要在 3 小时内离心（以减少 cfDNA 的降解和假阴性结果的风险），产生 3 mL 的血浆，随后使用市售的试剂盒进行 cfDNA 提取。然后可以对提取的 DNA 应用各种测序方法，包括 qPCR、液滴数字 PCR 和高通量测序基因检测。分析技术必须对检测肿瘤特异性 cfDNA 非常敏感，这仅占总循环 cfDNA 的一小部分。

虽然血浆最常用于液体活检，但所有生物体液都可能代表用于检测的肿瘤 DNA 来源；然而，关于在非小细胞肺癌的基因组表征中使用这些替代来源指导治疗的数据有限。然而，有证据表明，在检测非小细胞肺癌和软脑膜转移患者的基因组改变方面，脑脊液检测可能比血浆更敏感 。也有人提出，血浆和尿液检测的结合可以提高非小细胞肺癌中EGFR突变检测的敏感性 。

液体活检还可以克服与组织活检相关的肿瘤异质性取样偏差和/或允许对肿瘤演变和对治疗的反应进行纵向研究 。液体活检的另一个优点是避免了组织采集的侵入性程序 。然而，有人担心过度依赖液体活检可能会导致一些实验室的组织病理学服务较差，而且该技术并非没有限制。例如，在最佳分析前程序或一致验证的阈值方面缺乏共识，以及报告指南的稀缺性。然而，关于液体活检的新建议正在出现 ，最值得注意的是国际肺癌研究协会 (IASLC) 于 2021 年发表的最新共识声明（见图 2）。此外，仍然存在假阴性的风险（敏感性约为 87%），因为并非所有肿瘤都会脱落足够的 cfDNA 进行检测，并且 cfDNA 测序无法区分激酶抑制剂治疗疾病反复背景下的形态学转变 。因此，cfDNA 分析的阴性结果应通过组织检测（必要时包括组织重新活检）来确认。作者认为，特异性问题可能是 cfDNA 中检测到的新标记的另一个重要限制因素。与对非小细胞肺癌具有高度特异性的EGFR突变不同，其他突变，例如BRAF p.V600E，见于不同的人类恶性肿瘤。对于这些突变，液体活检可以提供重要的额外信息来帮助决策，并可能导致识别出与预期不同的肿瘤或第二个肿瘤。克隆性造血也可能导致外周血细胞突变的扩大，如果液体活检结果被误解，可能会导致假阳性 。最后，挑战限制了通过基于 RNA 的新一代测序技术进行基因融合分析的液体活检。循环中可以发现无肿瘤细胞 RNA (cfRNA)，但由于分离程序问题和健康细胞的背景噪音问题，将 cfRNA 作为诊断工具进行评估的研究由于重现性和特异性差而受到阻碍。从血浆中保存、提取和测序细胞外 mRNA 的新策略可能有助于在未来克服这些障碍 。鉴于目前的局限性，建议尽可能进行基于组织的检测，并应在每个实验室建立组织利用和液体活检的详细方案，以评估预测性生物标志物 。

图 3:液体活检用于晚期/转移性非小细胞肺癌的诊断算法（更新的 IASLC 共识声明）。图转载自 , J Thorac Oncol, Vol. 16，Rolfo C 等人，晚期非小细胞肺癌的液体活检：国际肺癌研究协会的共识声明，第 1647-1622 页。版权所有 (2021)，经 J Thorac Oncol 许可。由 Elsevier Ltd. 出版。保留所有权利。顺序方法：组织后继 cfDNA 互补方法，同时组织和 cfDNA，血浆优先方法，cfDNA 先。cfDNA游离 DNA，IASLC国际肺癌研究协会，NSCLC非小细胞肺癌

细胞学标本结果解读

细胞学样本已被证明适用于肺癌患者的基因组分析 。然而，由于细胞结构的视觉验证并不总是可能的，根据作者的经验，在没有检测到变异的情况下，应考虑潜在的假阴性结果。有几个因素可能会限制来自细胞学样本的生物标志物检测的正确性，包括分析的潜在少量肿瘤细胞可能无法概括肿瘤异质性、DNA/RNA 输入量低以及肿瘤细胞与非转化细胞的比例低。

 

报告生物标志物结果

正确报告生物标志物测试结果对于及时提供最佳治疗至关重要，特别是考虑到越来越多的关注点是尽量缩短从转诊到专科护理到开始治疗的时间 。然而，报告的复杂性随着临床相关生物标志物数量的增加而增加，并且需要标准化。尽管多标志物小组报告可能包括有关潜在有益治疗类别的信息，但使用更大的小组可以识别意义未知的变体，从而可能使解释复杂化 。ESCAT 排名可以帮助临床医生优先考虑生物标志物测试，因此可以改善解释 。总体而言，已发现许多报告缺陷阻碍了对测试结果的解释 。由于临床医生必须向患者传达研究结果并最终负责选择合适的靶向治疗，因此 2020 年对肿瘤学家对基因组检测的信心调查发现，他们对使用单基因检测更有信心，而对使用多标志物的信心不足，这也许不足为奇。指导患者护理的小组测试 。

为了解决与报告分子病理学结果相关的日益复杂的问题，国际标准化组织 (ISO) 提出了关键报告标准。这些标准建议报告包括对结果的解释，并附有警告或解释性说明（在相关的地方）。作者认为，包含有关潜在局限性的信息可能与非小细胞肺癌中的小样本生物标志物检测特别相关，其中原始样本的质量或充分性可能会影响结果或解释。在此基础上，作者建议包括对诊断确定性的评论（即假阳性的可能性[例如存在意义不确定的变体或低等位基因频率的变体]或假阴性结果[由于低细胞性]）。专家组关于非小细胞肺癌诊断程序的建议还提倡在实验室报告中进行临床解释，特别是通过包含关于癌症对特定类别药物有反应或抵抗的可能性的声明 。为支持这些建议，最近对非小细胞肺癌分子病理学请求表和报告中存在的成分进行的一项观察性研究发现，病理学家和/或分子生物学家和临床医生认为最重要的报告项目是对检测结果的临床解释；该研究还提出了便于完成报告的模板 。最近，Kerr 及其同事 也审查了报告标准，其建议见表​​​3.

表3：医学实验室的报告标准，改编自 ISO 15189，以及生物标志物测试的其他注意事项

类别	最低 ISO 15189 标准	生物标志物测试的其他注意事项
一般的	• 结果报告应正确、清晰、明确，并符合特定的程序说明   • 实验室应定义报告的格式和媒介以及传达报告的方式 • 实验室应有程序确保实验室结果转录的正确性 • 实验室应有一个流程，用于在检查延迟时通知请求者	• 应结合组织/细胞病理学结果报告分子检测数据，以确保临床相关性   • 在 5-10 个工作日内提供报告 • 测试结果应在 MDTB/MTB 上讨论
报告属性	• 评论可能影响检查结果的样本质量   • 根据接受/拒绝标准对样品适用性进行评论 • 包括关键结果 • 解释对结果的评论	• 包括关于癌症对靶向治疗有反应（或抵抗）的可能性的陈述和/或在 MDTB/MTB 上讨论结果的建议
报告内容	• 包括一个清晰、明确的检查标识，包括在适当情况下的检查程序   • 确定发布报告的实验室 • 确定由转诊实验室进行的所有检查 • 说明原始样本的类型和采集日期 • 说明测量程序b • 应以 SI 单位、可溯源到 SI 单位的单位或其他适用单位报告检查结果 • 说明生物参考区间、临床决策值，或包括支持临床决策值的图表/列线图b • 酌情包括对结果的解释 • 确定作为研究或开发计划的一部分进行的检查	• 包括对用于分析的材料的描述，包括分析前参数，例如固定剂和固定时间、肿瘤细胞富集方法和最终肿瘤细胞含量和/或 DNA 量   • 说明所使用的分析技术、所用测试的详细信息、测试的已知限制以及相应的阳性/阴性预测值（如果已公布）

 

表格改编自 Kerr 等人。版权所有 © 2021 作者。由 Elsevier BV 出版 保留所有权利。根据知识共享署名 4.0 国际 (CC BY 4.0) 许可条款复制

ISO国际标准化组织、MDTB多学科肿瘤委员会、MTB分子肿瘤委员会

^a在适用的情况下；各国在治疗指导方面可能有所不同

^b适用时

正如 ISO 要求中所强调的那样，对实验室结果的完整解释可能需要实验室内无法获得的临床背景 。在这些情况下，由来自不同临床专业的医疗保健专业人员组成的多学科团队是解释复杂遗传信息的基础，并协同工作以确定个体患者的最佳临床管理 。基于大量可操作的突变和可用的靶向治疗，NSCLC 患者的临床决策可能特别具有挑战性。在许多国家，由来自不同专业的医疗保健专业人员组成的多学科肿瘤委员会 (MDTB) 对所有新诊断的非小细胞肺癌患者进行管理是强制性的；可能还需要分子肿瘤委员会 (MTB) 来讨论具有罕见突变或复杂突变谱的复杂病例 。除了解释与样本质量相关的分子发现（例如肿瘤含量和假阴性风险）之外，在组织诊断的整体背景下审查任何发现也很重要。罕见的腺癌亚型和合并组织学的肿瘤以及其他因素可能会影响或解释不寻常的分子发现。

虽然获得当地 MDTB/MTB 被认为是必不可少的 ，但并非所有晚期非小细胞肺癌患者都能获得从这些讨论中获得的建议。许多患者不需要讨论（例如，确定了一种明显的改变，例如EGFR突变或ALK融合）；因此，一些肿瘤学家仍然对 MDTB/MTB 的益处持怀疑态度 。一些 MTB 支持三级医疗中心和周边医院之间的区域合作，以增加患者人数 。MTB 也可以在国内或国际上运营；例如，欧洲癌症核心网络  内的七个欧洲癌症中心建立了一个具有自动新一代测序技术数据解释和报告功能的 MTB 门户。最终，MDTB/MTB 的目标是为医生提供针对个体患者的最佳和可用的个性化治疗方案的建议。

由于预计在 COVID-19 大流行之后远程医疗将继续发展，因此应在适当情况下考虑实施虚拟 MDTB/MTB，因为它们可能有助于提高多学科护理的效率 。此外，为转移性非小细胞肺癌患者实施临床路径可能支持临床决策并帮助管理资源 。

 

外部质量评估/控制

无论选择何种测试方式，实验室都必须进行充分的内部和外部过程验证和质量评估 。在许多国家，参与外部质量评估 (EQA) 计划是强制性的，因为 EQA 提供客观反馈，以最大限度地提高跨实验室诊断测试的正确性和标准化 。

目前有多个国际和欧洲组织针对非小细胞肺癌开展 EQA 项目，表中总结了一些最大的项目​​​表 4。 EQA 提供者使用的测试样品来源多种多样，从人工福尔马林固定石蜡包埋材料、工程人类细胞系（具有受控肿瘤细胞含量的均质混合物）到真实人类肿瘤组织。后者最接近地反映了每个实验室在现实环境中面临的挑战。在样品分析之后，参与的实验室会生成一份书面报告，至少在某些 EQA 项目中，该报告会发送给 EQA 提供者进行审查和评估。随后，EQA 提供者会发布个人反馈报告，以帮助实验室提高绩效 。EQA 提供者可能会发布最成功参与者的实验室协议作为最佳实践的建议，从而帮助在结果不佳的实验室中实施纠正措施。

表 4：欧洲最大的非小细胞肺癌 EQA 项目总结

EQA 提供商	非小细胞肺癌靶点	关联
欧洲病理学会 EQA (ESP-EQA)	EGFR、KRAS、BRAF、MET、ALK、ROS1、PD-L1	http://lung.eqascheme.org/
EMQN中投	KRAS、EGFR、BRAF	https://www.emqn.org/eqa-scheme-catalogue/
基因组学质量评估 (GenQA)	EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、PIK3CA、RET、MET（扩增）、MET（外显子 14 跳跃）、ERBB2/HER2（仅限 SNV）	https://genqa.org/eqa
Gen&Tiss（法国国家 EQA 计划）	KRAS、EGFR、BRAF	http://www.genetiss.org/
Qualitätssicherungs-Initiative Pathologie (QuIP)	克拉斯、表皮生长因子受体	https://www.quip.eu/de_DE/

 

ALK间变性淋巴瘤激酶，BRAF B-Raf 原癌基因，EGFR表皮生长因子受体，EQA外部质量评估，ERBB2 Erb-B2 受体酪氨酸激酶 2，HER2人表皮生长因子受体 2，KRAS Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，MET肝细胞生长因子受体，NSCLC非小细胞肺癌，PD-L1程序性细胞死亡配体 1，PIK3CA磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 3-激酶催化亚基 α，转染过程中重排的RET ， ROS1 ROS 原癌基因 1，SNV单核苷酸变体

EQA 有几个限制。与正确医学相关的日益增加的基因组复杂性排除了每个感兴趣的诊断参数的 EQA；例如，样品制备通常被排除在外 。因此，EQA 不能替代内部质量控制和适当参考材料的常规使用 。此外，参与 EQA 会产生相关成本，以及实验室进行参与所需测试的资源成本。此外，如果每年测试多个样品，测试成本可能会超过参与费。最近，几个 EQA 提供商组织了 cfDNA 试点 EQA 计划，例如 EMQN CIC、基因组质量评估 (GenQA)、欧洲病理学会 (ESP) 基金会、Gen&Tiss 和 Qualitätssicherungs-Initiative Pathologie (QuIP)。此外，国际病理学质量网络 (IQN Path) 组织了一个协作 cfDNA 试点计划（包括 ESP、Associazione Italiana di Oncologica Medica [AIOM]、EMQN CIC 和 GenQA）；结果于 2018 年发表 。该试点计划证明了验证 cfDNA 检测方法的重要性，并建议实验室审查其 EQA 结果以限制分析检测错误的数量 并改进向转诊临床医生报告实验室结果。

在采用和协调新型生物标志物时，EQA 计划尤为重要。有强有力的证据表明 EQA 程序在提高患者的生物标志物检测正确性方面发挥着重要作用（图 1）。

图 4:2012-2015 年欧洲病理学会运行的 EQA 计划中EGFR、ALK和ROS1的肺癌生物标志物分析的错误率。图改编自 Keppens 等人。版权所有 © 2021 作者。由影响期刊出版。版权所有。根据知识共享署名 3.0 国际 (CC BY 3.0) 许可条款复制。ALK 间变性淋巴瘤激酶、EGFR 表皮生长因子受体、EQA 外部质量评估、FISH 荧光原位杂交、IHC 免疫组化、ROS1 ROS原癌基因1

诊断实验室的 ISO 15189:2012 认证也反映了 EQA 的重要性，这需要参与 EQA 计划 。在一些但不是所有国家，EQA 提供者可以直接将实验室表现不佳的信息传递给有关当局（例如，英国皇家病理学家学院的国家质量评估咨询小组和比利时的 Sciensano）。

 

非小细胞肺癌基因检测及其应用专家结论

鉴于肺癌中越来越多的生物标志物和相关的组织限制，预测性生物标志物的测试必须遵循最佳方法，以最大限度地提高有限组织样本的诊断率。这导致从测试一个或多个单个标记的单基因方法过渡到以下一代测序技术为代表的多基因方法，后者更具成本效益（见表​​​5有关分析、报告和质量评估的关键方面的关键意见和建议的摘要）。在可用于诊断/分子检测的组织有限的情况下（PD-L1 除外，并且 IHC 是先进方法），单独的高通量测序基因检测检测可能是合适的。同样，基于血浆的 NGS（尽管存在敏感性/特异性问题）和基于组织的方法是互补的方法，因为对组织检测结果的了解有助于解释循环 cfDNA 分析。无论使用何种测试方式，充分的内部验证和质量控制方案都是至关重要的。参与 EQA 计划有助于确保跨实验室测试的高水平正确性和标准化。最后，在 MDTB/MTB 的推动下，正确、详细地报告并解释测试结果，

表 5：围绕分析、报告和质量评估的关键方面的建议摘要

主要意见和建议a
生物标志物测试方法   多重和单基因检测 • 当需要测试多个目标时，NGS 比单基因测试更具成本效益 • DNA/RNA 联合高通量测序基因检测是一种高效且有效的方法，可全面检测晚期非小细胞肺癌中所有已批准和新兴的生物标志物（不包括 IHC 检测的 PD-L1） • 基于 RNA 的新一代测序技术与基于 DNA 的下一代测序技术并行提供了更高的检测基因融合的灵敏度 • 基于 RNA 的高通量测序基因检测允许鉴定基因转录本，得出关于框内基因融合的结论和鉴定基因融合伴侣 • RNA 和 DNA 的一步共提取以及 DNA 和 RNA 的同时新一代测序技术有助于减少组织消耗 • 混合捕获分析和锚定多重技术允许更广泛的融合分析，但比基于扩增子的方法需要更多的材料 基因融合的 IHC 测试 • IHC 可以补充和/或替代测序或 FISH 测试 • 通过 IHC 检测基因产物过表达是评估非小细胞肺癌中ALK、ROS1和NTRK融合的有用筛选工具 • 对于 ROS1 和 NTRK IHC + 病例，根据 ESMO 指南，必须通过另一种分子方法（例如 FISH、qPCR、NGS）进行确认 • 对于 RET 融合，不建议将 IHC 作为筛查工具，因为已报告了假阳性和假阴性病例 液体和组织活检 • 通过液体活检对血浆循环 cfDNA 进行测序是基于组织的生物标志物测试的补充方法 • cfDNA 测序分析可以使用在室温下储存在 EDTA 管中的低至 6 mL 外周全血进行 • EDTA 管中采集的血液应在 3 小时内离心，以减少 cfDNA 的降解和假阴性结果的风险 •分析技术必须高度敏感，以检测肿瘤特异性cfDNA，其仅代表总循环cfDNA的一小部分 •在非小细胞肺癌基因组特征分析中使用替代生物液体进行液体活检以指导治疗的数据有限 •鉴于液体活检的当前局限性（如假阴性），应尽可能进行基于组织的测试，并应在每个实验室建立组织利用和液体活检的详细方案，以评估预测性生物标志物 •由于肿瘤DNA脱落的变异性和假阴性的高风险，cfDNA分析的阴性结果应通过组织测试（如有必要，包括组织重新活检）进行确认 •应谨慎考虑cfDNA分析的阳性结果，因为克隆性血液病和其他因素可能导致假阳性 细胞学标本 •细胞学标本可适用于肺癌患者的基因组分析。然而，由于细胞性的视觉验证并不总是可能的，在没有检测到变异的情况下，应考虑潜在的假阴性结果
生物标志物结果报告   • 正确报告生物标志物测试结果对于及时提供最佳治疗至关重要 •ESCAT排名有助于确定生物标志物测试的优先顺序，因此可能改善解释 •应报告国际标准化组织（ISO）提出的关键标准，并包括对结果的解释，以及警告或解释性说明（如相关） •建议对诊断的确定性（即假阳性的可能性[例如存在不确定意义或低等位基因频率的变体]或假阴性结果[由于低细胞性]）进行评论 •欧洲非小细胞肺癌诊断程序专家组建议发表一份声明，说明癌症对特定类别药物产生反应或抵抗的可能性 • 由来自不同临床专业的医疗保健专业人员组成的多学科团队是解释复杂遗传信息的基础
外部质量评估/控制   • 实验室必须进行充分的内部和外部过程验证和质量评估 • 在许多国家，参与 EQA 计划是强制性的，因为 EQA 提供客观反馈，以最大限度地提高跨实验室诊断测试的正确性和标准化

 

^a如果没有指南或文献明确描述最佳实践，则根据作者组的经验报告最佳实践建议

ALK间变性淋巴瘤激酶、  cfDNA游离 DNA、DNA脱氧核糖核酸、EQA外部质量评估、ESCAT ESMO 分子靶标临床可操作性量表、ESMO欧洲肿瘤内科学会、EDTA乙二胺四乙酸、IHC免疫组化、NGS下一代测序、NSCLC非小细胞肺癌，NTRK神经营养酪氨酸受体激酶，PD-L1程序性死亡配体 1，转染过程中RET重排， RNA核糖核酸，ROS1 ROS 原癌基因 1

 

Expert opinion on NSCLC small specimen biomarker testing - Part 2: Analysis, reporting, and quality assessment.

Penault-Llorca F, Kerr KM, Garrido P, Thunnissen E, Dequeker E, Normanno N, Patton SJ, Fairley J, Kapp J, de Ridder D, Ryška A, Moch H.Virchows Arch. 2022 Jul 20:1-16. doi: 10.1007/s00428-022-03344-1. Online ahead of print.

 

 

 

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