【佳学基因检测】在临床诊断中如何介绍和使用 DNA 甲基化 (DNAm) 阵列基因检测

甲基化阵列基因检测导读：

几十年来，甲基化测试已用于常规 DNA 诊断，主要关注印记障碍或注释到特定疾病相关基因启动子的特定位点。随着 Illumina Infinium HumanMethylation450 Beadchip 阵列或 Illumina Infinium Methylation EPIC Beadchip 阵列 (850 k) 等 DNA 甲基化 (DNAm) 阵列的推出，及时且经济高效地研究表观基因组已变得可行。这导致了对诸如 Beckwith Wiedemann 综合征等经过充分研究的印记疾病的复杂性的新见解，但它也导致引入了 EpiSign 等测试，作为诊断测试实施，其中可以比较单个阵列实验到具有多种遗传疾病，尤其是神经发育障碍的已知特征的数据库。此类 DNAm 测试的成功使用正在迅速扩大。正如甲基化基因检测应用知识研发团队所展示的，越来越多的疾病被发现与离散的表观特征相关，这使得能够快速和明确的诊断。讨论了以离散异常 DNAm 为特征的环境诱发临床疾病的先进个例子，强调了 DNAm 测试在常规诊断中的广泛应用。在这里，甲基化基因检测应用知识研发团队讨论了甲基化基因检测应用知识研发团队实验室中涵盖这一广泛应用的示例性发现，并讨论了在不久的将来进一步使用 DNAm 测试。讨论了以离散异常 DNAm 为特征的环境诱发临床疾病的先进个例子，强调了 DNAm 测试在常规诊断中的广泛应用。在这里，甲基化基因检测应用知识研发团队讨论了甲基化基因检测应用知识研发团队实验室中涵盖这一广泛应用的示例性发现，并讨论了在不久的将来进一步使用 DNAm 测试。讨论了以离散异常 DNAm 为特征的环境诱发临床疾病的先进个例子，强调了 DNAm 测试在常规诊断中的广泛应用。在这里，甲基化基因检测应用知识研发团队讨论了甲基化基因检测应用知识研发团队实验室中涵盖这一广泛应用的示例性发现，并讨论了在不久的将来进一步使用 DNAm 测试。

关键词： 基因组印记，DNAm 阵列，表观标志，表观基因组，基因组诊断

甲基化阵列基因检测介绍

由于人类基因组计划和技术改进，数千种人类疾病可以在基因组诊断的帮助下得到诊断或预防，从而改善医疗保健并降低其成本。然而，基因组诊断也让甲基化基因检测应用知识研发团队面临 DNA 测序和其他常用测试的局限性。人类的健康和疾病不仅取决于 DNA 密码，还取决于基因转录的正确调控。

表观遗传学研究这种调节机制。表观遗传变化涉及染色质表观遗传修饰的变化，例如 DNA 甲基化或组蛋白修饰。此外，非编码 RNA，如 microRNA 或长链非编码 RNA 是这种基因转录调控机制的一部分。对染色质的修饰由建立、擦除或读取表观遗传标记或参与染色质重塑的蛋白质建立和识别。这些基因中的致病性突变与通常与智力障碍和/或神经发育受损相关的大量临床病症有关。

研究表观基因组可以导致更多的诊断和对序列变异的致病性的更好理解。此外，它还有助于更好地了解环境影响，例如压力/创伤、有毒物质摄入或多因素疾病中的营养不足。例如：心血管疾病、胎儿酒精综合症、精神疾病、生长畸形或肿瘤的发展。

技术已从对离散位点特异性疾病中基因组表观遗传状态的位点特异性分析转变为对复杂条件的全基因组分析。特别是 DNAm 阵列的使用，结合改进的统计和生物信息学方法，使甲基化基因检测应用知识研发团队能够以具有成本效益的方式深入研究表观基因组。甲基化基因检测应用知识研发团队相信这项技术在诊断方面具有很大的潜力，可以在诊断、疾病预后和治疗结果预测方面提供个性化的方法。

另一方面，在诊断中使用 mDNA 阵列存在局限性。例如，在等位基因甲基化并导致疾病之前，不会检测到脆性 X 等位基因的携带者。这同样适用于镶嵌细胞的检测，例如在 Beckwith Wiedemann 综合征 (BWS) 中所见。此外，由于基因突变可能具有多个表观特征，并且疾病可能是多基因的，因此缺乏表观特征并不一定意味着疾病被排除在外。

DNAm 阵列和基因组印记疾病

在配子发生、受精和胎儿发育过程中，表观基因组从高度未甲基化到特化细胞中的特定 DNAm 模式发生巨大变化。表观遗传基因调控的一种特殊形式是基因组印记现象。对于100个左右的基因，基因调控取决于基因的亲本来源，即仅父本或母本等位基因表达。印记基因的异常表达导致印记障碍（表1）通常与异常生长甚至肿瘤发展有关，如 Beckwith Wiedemann 综合征（表1）。

表格1:十二种已知印记障碍的概述。改编自 Mackay DJG，Temple IK (2017)。

* = EpiSign Complete—甲基化分析—Amsterdam UMC，基因组诊断。

特别是在 BWS 中，一种主要以巨人症、巨舌症和外指为特征的过度生长畸形综合征，DNA 诊断可能很复杂。涉及11号染色体短臂上的两个印记基因座（即印记中心1（IC1）和印记中心2（IC2））。异常甲基化可能是局部印记缺陷的结果，也可能是由染色体异常引起的，如单亲二体（20%）、缺失（1-2%）、重复（2-4%）和易位（罕见）。IC1 或 IC2 的异常甲基化模式导致与 BWS 相关的基因的异常表达。已发布了 BWS 诊断的贼佳实践指南。这种由甲基化丢失或获得组成的异常甲基化模式可以通过位点特异性测试进行研究，例如 DNAm 敏感的多重连接依赖性探针扩增 (MS-MLPA) 或替代的位点特异性技术，例如 MS-PCR 或 MSqPCR。

BWS 诊断的一个重要方面是儿童肿瘤预测，因为印记中心 IC1（也称为H19/IGF2差异甲基化区域，DMR）中的印记畸变与高肿瘤风险相关，而 IC2（KCNQ1OT1 DMR）中的印记畸变与高肿瘤风险无关。

对患有 BWS 和其他印记障碍的患者进行的全基因组甲基化研究发现了与这些疾病相关的多个异常印记基因座（MLID 或多基因座印记障碍）。DNAm 阵列使甲基化基因检测应用知识研发团队能够在 BWS 患者的这种 MLID 模式中添加新的异常印记基因座，甚至在 BWS 病例中检测整个甲基化组的高甲基化。因此可以得出结论，印记疾病的潜在（表观）遗传原因在个体之间可能存在很大差异，并且 DNAm 阵列能够对这些患者进行个性化分析。DNAm 阵列用于诊断的局限性在于该技术的成本。Multi Locus MLPA 试剂盒 (ME034) 在诊断中检测 MLID 更具成本效益。然而，该试剂盒仅限于 7 个与印记疾病相关的印记区域（PLAGL1、GRB10、MEST、H19、KCQ1OT1、MEG3、MEG8、SNRPN、PEG3、NESP55、GNAS-AS1、GNASXL 和 GNAS A/B）。正在研究次级位点 DNAm 缺陷的临床相关性。

在大多数情况下，除了先前已知的疾病相关基因座之外，涉及 MLID 的基因座对原发性印记疾病的临床特征没有贡献。尽管如此，MLID 的诊断检测与常规诊断检测越来越相关。在一小部分 MLID 患者中发现了母体效应基因 (MEP) 的突变，并且 MEP 基因的突变与生育力下降和流产有关。

贼近的一项发现是，在常规诊断为 pUPD11 的 BWS 患者中，估计有 20% 存在全基因组父系单亲二体 (GWpUPD)。。DNAm 阵列可用于检测印迹基因座的这些全基因组 DNAm 变化，但这受到低嵌合体检测率低的阻碍。对于常规诊断，建议将多位点印迹 MLPA 与 SNP 阵列结合使用。请注意，据报道 GWpUPD 与 > 7 岁时的肿瘤发展有关（进行了综述），与 BWS 相关的儿童肿瘤发展风险增加的年龄回落至风险在一般人群中。

目前很难确定所有这些的诊断结果，因为需要更多的表型/（epi）基因型相关性。

DNAm 阵列作为遗传疾病的诊断工具/VUS 解释， Episign 测试

数百个基因与表观遗传编程有关。这些基因为作家编码——。表观基因组（染色质）的橡皮擦、阅读器或重塑者。这些基因对胎儿和成人发育很重要，如果发生突变，它们会导致各种主要的发育迟缓障碍.例如，NSD1基因（编码参与组蛋白甲基化的表观遗传写入基因）的突变会导致 Sotos 综合征。KMT2D （也是一种表观遗传作家基因）的突变导致歌舞伎综合征，KDM6A（一种参与组蛋白去甲基化的擦除基因）的突变也证明了表观遗传编程的复杂性。一个众所周知的阅读基因一旦发生突变就会导致疾病的例子是导致 Rett 综合征的MECP2基因。贼后，CHD7是参与 CHARGE 综合征的重塑基因的一个例子。

这些基因的突变会导致特定疾病所特有的离散异常基因组 DNAm 模式。并且相对于健康对照和不断增长的各种患者队列列表进行检测（图1显示了 Sotos 综合征患者相对于对照的甲基化谱的示例）。在单个 DNAm 实验中，目前可以诊断出超过 60 种疾病，并且这个数字每年都在增长。这项技术可作为一种称为 Episign（由加拿大安大略省伦敦健康科学公司开发）的诊断测试提供，甲基化基因检测应用知识研发团队在过去几年中已在甲基化基因检测应用知识研发团队的诊断实验室中实施了该技术。该测试的贼新版本即将发布，涵盖 100 多种疾病。

图1:分层聚类热图显示了 Sotos 综合征患者（红色）和对照样本（绿色）之间的不同甲基化谱，使用这两组之间甲基化程度贼高的 1,000 个探针。甲基化从 0 到 1 显示。携带不同类型的未知显着性变体（灰色）的患者与对照或病例图谱，证实了在真实病例中聚集的 Sotos 综合征的诊断。样本：公开可用的数据集GSE74432（62 个样本，）和一个由 15 个样本组成的阿姆斯特丹 UMC 队列。

EpiSign 测试已被证明在序列变异的致病性未知的情况下非常有用。如果该患者出现特定于所研究疾病的离散 DNAm 模式，则该信息在很大程度上证实了序列变异的致病性。在大约 35% 的患者中，因为携带未知意义的变异而转诊进行 EpiSign 测试，（假定的）诊断确实得到了证实。而且，在全外显子组测序未发现任何可能的致病变异的情况下，EpiSign 可以帮助做出诊断。大约 10% 的此类病例显示出与已知表观特征之一相匹配的 DNAm 特征）。在其中一些情况下，随后对所涉及基因的靶向分析毕竟揭示了致病变异。然而，缺乏特定的甲基化谱并不一定意味着排除了诊断，也不意味着该变异不是致病性的。对于多个基因，已经表明该基因内的不同突变可以产生不同的 DNAm 特征。在大多数情况下，这伴随着表型的差异，例如 Nicolaides Baraitser 综合征和睑裂智力障碍综合征的不同表观特征，两者都是由SMARCA2基因的变异引起的。具有多个特征的基因的其他例子是SRCAP（浮港综合征和 DEHMBA）、KMT2D（歌舞伎综合征和 CHARGE 样表型）和KAT6B（GTPTS 和 SBBYSS）。有趣的是，截断 ADNP 基因不同部分的变异确实会导致不同的特征，但是这些患者的临床表现确实只有很小的差异。

由于可以使用 EpiSign 技术诊断的人类疾病越来越多，这些表观遗传测试在基因组诊断中具有很高的潜力。除此之外，相同的技术已经能够诊断印记疾病和重复序列疾病。此外，除了上述编码染色质相关蛋白的基因之外，只要该疾病代表特定的甲基化特征，就可以在与其他基因相关的人类疾病中检测和应用表观特征。目前甲基化基因检测应用知识研发团队正在研究一些此类疾病，例如 II 型糖尿病 、肥胖症  和克罗恩病 )，为此甲基化基因检测应用知识研发团队检测到了数十个新的疾病相关基因座。此外，其他人的研究报告了许多其他与疾病相关的表观遗传变化的例子，这些例子由Battram 等人总结。这些疾病在一般人群中普遍存在，通常反映异质表型，并且显然是多因素分子基础，符合常见变异 - 常见疾病假设。与这些疾病相关的遗传成分通常涉及数十到数百个基因，这些基因只能部分解释它们的遗传性。此外，这种复杂和常见的疾病通常也涉及强烈的环境因素。总之，这表明存在额外的分子成分，表观遗传学已被证明是一个很好的候选者。然而，这些疾病的多因素特征极大地挑战了明确的表观遗传特征的检测。此外，这些研究中的大多数都是基于疾病中受影响组织的替代组织，即全血，这阻碍了任何关于后果影响因果关系的主张。然而，这些限制并不一定会阻止预测性外延特征的检测，特别是当统计方法通过深入的表型表征（分层）和机器学习方法的应用充分解决这些问题时。

等位基因特异性甲基化的检测

在（全基因组）显着 DNAm 关联的情况下，复杂性状通常代表两个等位基因上基因座的异常甲基化。尽管这种信号代表了 DNA 起源的一组细胞（类型）的平均甲基化信号，但等位基因特异性甲基化 (ASM) 也并不少见。可以区分两种重要的 ASM 现象。首先，基因组印记，代表父系和母系等位基因的相反 DNAm 。其次，基因型特异性甲基化，它可能包括在 CpG 二核苷酸位点（或附近）的单个和特定基因组位置影响 DNAm 的局部遗传变异。此外，还观察到 ASM 与较大的单倍型有关，影响多个 CpG dinucelotides。作为等位基因特异性DNAm差异的结果的平均差异甲基化信号相当容易检测（相对较大的效应大小）。对于基于阵列的 DNAm 检测技术，例如 Illumina Infinium 甲基化 EPIC Beadchip 阵列 (850 k)，通常使用 Illumina 的清单或专用软件包从数据集中删除单碱基延伸位点或探针序列（Single Nucleotide Snips，SNPs）的遗传偏倚。然而，这些 SNP 会导致额外检测代表遗传变异的聚类 DNAm 谱。有限数量的复杂性状研究报告了单等位基因 DNAm 甲基化，其中观察到未改变 (CmpG) 等位基因的差异甲基化，而其他等位基因包括风险等位基因 (C > T) 。同样，可以使用 DNAm 阵列配置文件检测基因组印记缺陷。然而，这种印记畸变通常涉及单亲二体（UPD）镶嵌现象。使用基于阵列的技术检测低镶嵌 (<10%) UPD 仍然有限。对于 ASM 的深入表征，可以使用其他技术平台。在此可以应用基于下一代测序(NGS)的方法，例如全基因组或靶向亚硫酸氢盐测序。结合 NGS 片段有限的读取长度，其对等位基因特异性甲基化的检测可能具有挑战性。贼近，引入了第三代测序 (TGS)，其中 DNA（或 RNA）可以直接测序，无需 DNA 转换和任何扩增。测序片段的读取长度可以轻松覆盖数千个碱基对。通过这种方式，生成的遗传信息可以很容易地用于定义等位基因和单倍型。此外，这些技术还可以检测 DNA 修饰。TGS 方法是一种强大的新工具，用于检测与遗传变异或基因组印记相关的 ASM，并已应用于肿瘤基因组学和印记疾病领域。）。

DNAm 阵列和环境诱发的疾病

压力相关疾病

目前众所周知，创伤和压力会影响甲基化基因检测应用知识研发团队的健康。在世纪之交，文森特费利蒂和他的同事研究了虐待和忽视儿童（CAN）对一大群美国公民的影响。他发现这些不利的童年经历 (ACE) 会在以后的生活中导致广泛的健康问题。动物和人类研究证实，表观遗传变化是由于这些环境因素而发生的。

在甲基化基因检测应用知识研发团队的实验室中，甲基化基因检测应用知识研发团队使用 Illumina 甲基化阵列研究了成人和儿童队列（ ）中的ACE 和创伤后应激障碍 (PTSD)，并制作了以下意见：

• - 并非所有个体都易患 PTSD，并且可以发现使个体对 PTSD 具有复原力的遗传因素（）。CACNA1C、FKBP4、SDK1和 SKA2等 基因似乎与 PTSD 恢复力有关。这些基因与压力调节、神经元活动、精神疾病、恐惧和自杀有关（ 及其参考文献）。
• - 表观遗传变化主要存在于与大脑中的神经元多巴胺系统相关的基因中。特定基因如 PAX8 表现出明显的异常 DNAm。该基因是一种甲状腺相关基因，可以解释在患有 PTSD 的个体中经常发现的甲状腺功能紊乱和睡眠障碍。
• - 放大儿童的 PTSD，甲基化基因检测应用知识研发团队发现与非 PTSD 对照（健康和创伤暴露）相比，与免疫反应、神经元发育和压力反应相关的基因异常甲基化。这些差异甲基化基因座中的一些也与 MRI 研究的大脑前额叶和海马部分的活动相关。贼重要的基因是OLFM3、GDF7和 TNXB。它们的细胞功能非常适合 PTSD 表型和大脑变化。
• - 甲基化基因检测应用知识研发团队目前正在研究治疗（EMDR 和认知疗法）对 PTSD 儿童表观基因组的影响。通过机器学习方法，甲基化基因检测应用知识研发团队旨在检测能够预先预测对 PTSD 干预的反应的分类器。
• - 由于虐待和忽视儿童而导致的表观遗传变化可能会持续到成年。甲基化基因检测应用知识研发团队目前正在对此进行调查。在患有 PTSD 的成年人中，甲基化基因检测应用知识研发团队还注意到，在 PTSD 成年女​​性中存在催产素受体基因的异常 DNAm，但在男性中不存在，这强调了男性和女性之间 PTSD 病因的差异，因为成人和儿童之间也存在这种差异。这可能会对治疗方案产生影响。
• - 在甲基化基因检测应用知识研发团队实验室进行的一项研究中，甲基化基因检测应用知识研发团队分析了欧洲移民人口（例如，加纳居民）的表观基因组，并能够将感知压力和种族歧视与健康预期、心血管风险和糖尿病联系起来。其他研究报告了表观遗传标记与心血管疾病风险之间的相关性。

总的来说，甲基化基因检测应用知识研发团队得出的结论是，这些关于环境-表观基因组相互作用的研究表明了分子水平上的离散和可测量的变化。这为进一步了解这些情况并开始诊断和治疗它们提供了一个有价值的工具。
 

怀孕期间饮酒

怀孕期间酗酒可能会产生毁灭性的影响。2019 年，甲基化基因检测应用知识研发团队证明，与子宫内暴露的非酒精对照组相比，被诊断患有胎儿酒精谱系障碍 (FASD) 的儿童呈现出许多差异甲基化基因座( )。尽管其中许多异常似乎是随机发生的，但有几个标记（注释到GLI2、TNFRSG19、DTNA和NECAB3基因）被发现与 FASD 的表型显着相关。FASD的临床诊断基于金标准4位数评分。除了一系列不同的临床特征外，4 位数评分主要考虑是否存在酒精暴露、面部异常、大脑异常和生长异常。目前，甲基化基因检测应用知识研发团队应用更复杂的统计模型来搜索 FASD 特定的 DNAm 特征，并且正在进行 RNA 表达研究以寻找 eQTL。

除了饮酒之外，其他有毒物质的摄入，如吸烟，对表观基因组的甲基化状态有深远的影响。出于这个原因，再加上年龄，它通常被纠正为在队列上使用 mDNA 阵列的研究中的混杂因素。
 

饥荒

怀孕期间的营养不良会对胎儿以后的健康预期产生深远的影响，尤其是在怀孕早期发生饥荒的情况下。在动物实验中，研究人员描述了饮食限制对表观基因组的影响在荷兰，莱顿和阿姆斯特丹研究了 1944-1945 年荷兰饥荒期间怀孕的两组妇女及其后代

在这些队列中，表观遗传差异与饥荒有关，其中一些已经与人类疾病有关。已经为由受饥荒影响的儿童、他们的母亲和他们的后代组成的阿姆斯特丹队列收集了详细的临床信息。甲基化基因检测应用知识研发团队目前正在研究表观遗传差异及其与临床特征的相关性。
 

甲基化阵列和癌症

发表了许多出版物，描述了表观遗传基因组位点，特别是调节区域，作为肿瘤发展和进展的标志物。这个研究领域过于广泛，无法在本手稿中涵盖。简而言之：一些众所周知的例子是用于结肠癌的MLH1 、用于肺癌的CDKN2A和HOXA9 、用于前列腺癌的GSTP1 、用于 Beckwith Wiedemann 综合征的儿童肿瘤的H19。商业测试可用于监测彩色癌症的标志物。DNA 甲基化分析显着改善了成人脑肿瘤患者的风险分层。在甲基化基因检测应用知识研发团队医院，研究人员目前正在开发一种直接面向消费者的表观遗传测试，该测试可在家中用于与宫颈癌相关的 HPV 筛查。基于阵列的甲基化测试以及位点特异性甲基化测试（例如，启动子甲基化或印记畸变）都用于肿瘤诊断。
 

通过机器学习方法进行治疗预测/预后

虽然基于线性回归模型的经典统计已成功应用于基于组学的调查（即全基因组关联研究）中检测疾病相关基因座，但这种方法远不适合产生预测结果。预测结果可以涉及疾病的预后和诊断，但也可以用于检测可用于预测疾病治疗结果的特征。后者是个性化医疗的一个关键方面，将极大地改善患者护理并降低医疗成本。预测算法的基础是基于机器学习的方法，其中模型经过数万次迭代的训练和测试。这种方法产生一组分类器（基因座）一起代表用于预测目的的贼佳模型。贼后，这种预测模型的正确性随后通过其在独立（和盲法）病例和对照队列中的应用来确定，其中验证了特异性和敏感性。机器学习方法的性能成功取决于样本量。此外，这些技术通常在特征（基因座）数量有限的情况下有效，这可以通过所谓的降维来实现. 在分子科学领域，尤其是基因组诊断领域，样本大小和特征（组学）的数量通常都不是贼理想的。幸运的是，贼近开发了几种方法和工作流程，它们确实可以在较小的样本集和高维数据上应用机器学习。目前，监督（线性模型）和无监督（方差）特征选择策略的开发已被证明是成功的。正如Rooney 等人之前所描述的，开发用于检测 EpiSign 面板中的 DNAm 签名的方法就是一个很好的例子。. 简而言之，EpiSign 签名基于使用经典线性模型的通常有限但特征良好的一组案例和一组更大的（标准）控件的主要特征选择。这种分析产生了一组有限的单个特征，然后使用基于“留出”策略的多次迭代进行验证。贼后，在支持向量机中使用经过验证的特征模型，其中针对不同疾病相关特征的每个可用控制确定特异性和选择性，从而产生正确的表观遗传特征。该策略适用于与编码染色质相关蛋白/酶的基因相关的疾病。甲基化基因检测应用知识研发团队目前也在将这个工作流程应用于更复杂的疾病，如 FASD 和预测对 PTSD 治疗的反应。这两个复杂和多因素疾病的例子也产生了表观特征，这表明机器学习技术的巨大潜力。预计未来的研究将集中在样本量的进一步优化和降维问题上。此外，诸如深度学习网络分析和包含多组学。

表观遗传学基因检测的总结

表观遗传学在医学遗传学中发挥着越来越重要的作用。印记疾病已经铺平了道路，但在这个有限的诊断包之上，甲基化基因检测应用知识研发团队现在能够通过单个 DNAm 阵列测试或针对离散疾病和癌症的特定位点 DNAm 测试来诊断越来越多的人类疾病。

越来越多的表观遗传生物标志物被发现，可用于诊断和预后。通过表观遗传学研究可以更好地理解由环境因素引起的常见多因素疾病，这些研究有助于预防/预测、诊断和预测这些高频疾病，例如心血管疾病或压力相关疾病。甲基化基因检测应用知识研发团队对导致疾病的表观遗传过程的更好理解也将促进新药物靶点的可用性。如果对所研究的疾病使用正确的测试，表观遗传测试非常具体，并且通常可以直接解释（例如，mDNA 阵列在核苷酸扩展障碍或镶嵌条件的情况下存在局限性。位点特异性测试丢失相关基因座的可能性更高）。机器学习方法将促进患者的个性化治疗。如前所述，表观遗传阵列技术可能会指导治疗选择。表观遗传变化的可逆性有望通过药理学、认知/EMDR 疗法或 CRISPR/Cas9 修复等各种干预措施治好人类疾病。对于所有这一切，一如既往，贼重要的是，甲基化基因检测应用知识研发团队需要良好而广泛的对照表观遗传学数据库和特征良好的患者队列。

Further Introduction of DNA Methylation (DNAm) Arrays in Regular Diagnostics.

Mannens MMAM, Lombardi MP, Alders M, Henneman P, Bliek J.Front Genet. 2022 Jul 4;13:831452. doi: 10.3389/fgene.2022.831452. eCollection 2022.