【佳学基因检测】分子诊断与基因检测中的数字PCR技术
数字PCR是PCR技术发展过程中的第三代聚合物酶链扩增技术。数字扩增技术常写为DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR。虽然其基本原理仍然是1993年化学奖得主美国生物化学家穆利斯发现的,但是佳学基因通过终点检测计算目标序列的拷贝数,无需采用内参和标准曲线即可进行正确的先进定量检测。
数字PCR采用终点检测,不依赖于Ct值(循环阈值),所以数字PCR反应受扩增效率的影响降低,对PCR反应抑制物的耐受能力提高,具有很高的正确度和重现性。
由于具备高灵敏度、高正确度的特点,基因检测不易被PCR反应抑制剂干扰,无需标准品可实现真正意义的先进定量,而成为研究和应用热点。
根据反应单元的不同形式,主要可分为微流体式、芯片式和微滴式三大类系统。
1)微流体数字PCR,Microfluidic digital PCR,mdPCR。
基于微流控技术,对分子诊断DNA模板进行分液,微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成,但液滴需要特殊吸附方式再与PCR反应体系结合,mdPCR已逐渐被其他方式取代。
2)微滴数字PCR,Droplet-based digital PCR,ddPCR。
利用油包水微滴生成技术对分子诊断样品进行微滴化处理,将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴,其中每个微滴或不含待检核酸靶分子,或者含有一个至数个待检核酸靶分子。
以伯乐的ddPCR为例,主要包括三个步骤:
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先进,准备样本和生成微滴,如下图,8x3的微孔板,一排加样本,一排加油滴,通过微滴生成器每个样本生成20000个微滴。
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第二,进行“油包水”PCR,把微孔板放入PCR扩增仪,对每个微滴进行40个热循环的PCR反应。
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第三,读取微滴结果,把微孔板放入读取仪,通过流式细胞技术获取每个微滴PCR终点结果的荧光信号,并用泊松分布原理纠正结果。
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Bio-rad去年上市的Bio-Rad QX ONE数字PCR系统整合了微滴生成、热循环反应及微滴读取等步骤,贼大程度减少人工操作。
配备四个独立的荧光检测通道,结合ddPCR特有的高阶多重PCR技术,可以在单反应孔中实现8重拷贝数变异(CNV)检测、5重突变检测或4重基因表达检测。
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3)芯片数字PCR,Chip-based digital PCR,cdPCR。
利用集成流体通路技术在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体,通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动,将样本液体分成大小一致的纳升级于反应孔种进行数字PCR反应,实现基因检测对特定基因序列的先进定量。
以法国Stilla technologies 公司的cdPCR技术为例,主要包括以下步骤:
先进,加样和生成微滴:将样本和PCR反应液加入微流控芯片,放入仪器中,仪器可通过物理方法生成单层平铺的20000~30000个微滴阵列。
第二,对每个微滴进行PCR扩增:在Naica Geode微滴生成扩增系统自动进行PCR扩增。
第三,读取和分析结果:将芯片置于Prism微滴读取分析系统上进行荧光信号采集,计数阴阳性微滴,通过泊松分布计算获得靶标基因先进拷贝数浓度。
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总结一下,将分子诊断基因检测样本和PCR反应液加入微流控芯片,放入仪器中,通过物理方法生成单层平铺的微滴阵列,随后对每个微滴进行扩增,然后进行六通道荧光信号采集,计数阴阳性微滴,通过泊松分布计算获得靶标基因先进拷贝数浓度。
第三代PCR主要缺点:
仪器和试剂昂贵。
采用这种分子诊断技术模板质量要求较高,模板量超过微体系量将导致无法定量,过少则定量基因检测正确度降低。
当存在非特异性扩增时也会产生假阳性。
(责任编辑:佳学基因)