【佳学基因检测】如何设计并进行西妥昔和avelumab 治疗非小细胞肺癌的基因检测临床实验？

基因检测临床实验中外周血单个核细胞 (PBMC) 分离和乳酸脱氢酶 (LDH) 释放细胞毒性测定

参照《人类遗传病基因检测技术大全》，在 CAVE-Lung 试验患者中连续获得PBMC，在西妥昔单抗加 avelumab 治疗期间进行，并评估 LDH 释放细胞毒性试验。

下一代测序 (NGS)基因检测方法

在 CAVE-Lung 试验患者入组时收集血浆样本，作为肿瘤基因组分析的循环肿瘤 DNA (ctDNA) 的来源。 NGS 分析使用佳学基因肿瘤致病基因鉴定基因解码基因检测平台进行。使用 QIAmp DNA Blood Midi Kit (cod#51183) 从 PBMC 中提取基因组种系 DNA。按照试剂盒的操作指南，使用 Agilent SureSelect 人全外显子试剂盒 (Agilent) 生成测序文库，并在 NexSeq 平台 (Illumina) 上进行测序。使用 Burrow-Wheeler Aligner 将测序数据与人类参考 GRCh37/hg19进行比对。 SNV 和插入缺失根据佳学基因质量控制标准进行获取，这些标准包括：低复杂性、重复区域和片段重复被过滤掉；质量得分 ≥ 20，深度 ≥ 10，杂合子标准AB≥0.2；数据获取率 ≥ 0,85。在获得基因突变位点后，通过应用三个过滤步骤强化罕见突变的获得：I）gnomAD 中 MAF 为 1% 的基因突变； II) 基因突变类别，包括错义、蛋白质截断和调节；突变效应，变异导致蛋白质截断，并被预测工具（SIFT、POLYPHEN-2、MUTATIONTASTER、MutationAssessor、FATHMM 和 FATHMM-MKL）预测为有害； iii) InterVar 和 ClinVar 数据库中分类为致病性、可能致病性或 VUS 的基因突变。详细信息请参阅佳学基因其他基因检测技术文章。

肿瘤靶向用药基因解码基因检测中如何应用流式细胞仪分析

对于流式细胞术（荧光相关细胞分选，FACS）分析，PBMC 用染色缓冲液（SB）（2% 胎牛血清，FBS，磷酸盐缓冲盐水中的 0.1% 叠氮化钠）中洗涤，并在封闭染色缓冲液加20%封闭血清中封闭10分钟后，用以下单克隆抗体染色 30 分钟：抗 CD107a、抗 TIM-3 和抗 PD-L1（Miltenyi Biotec）。将染色的细胞洗涤两次，重新悬浮在染色缓冲液中，使用 FACS ACCURI C6 上使用 ACCURI C6 软件（BD Biosciences）获得细胞表面抗体的表达数据。

肿瘤基因解码时如何用来自患者肿瘤样本进行体外三维 (3D) 培养物的活力测定

根据《肿瘤致病基因鉴定基因解码及基因检测技术实验指南》，从 3 名 NSCLC 患者肿瘤样本中分离离体 3D 培养物。将所得肿瘤球体以 1 × 1000 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板中，并用指定的药物进行处理。根据检测试剂盒的使用说明，使用 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) Assay Kit (Abcam) 测量细胞增殖和细胞毒性。 MTS 测定方案基于 MTS 四唑化合物被活细胞还原以产生可溶于细胞培养基的有色甲臜染料。通过测量 490–500nm 处的吸光度来量化甲臜染料。

定量实时聚合酶链式反应 (PCR)

关于如何采用定量实时 PCR进行基因检测。根据《基因检测实验室操作指南》进行总 RNA 提取和 RT-qPCR（实时定量 PCR）。根据所要检测的序列设计引物序列。为了计算相对基因表达值，使用 2-ΔCt 或 2-ΔΔCt 方法。通过解离曲线分析和使用非模板对照排除了由引物二聚体引起的非特异性信号。

TCGA 数据库的基因表达分析

癌症基因组图谱 (TCGA) 数据集包括 511 例肺腺癌和 501 例肺鳞癌，以及转录组和基因组图谱的可用数据。

统计分析

使用 Graphpad Prism 软件 V.6.0（Graphpad Software，San Diego，California，USA）进行统计分析。